Massenzytometrie
Die Massenzytometrie oder CyTOF (Fluidigm) ist eine Variante der Durchflusszytometrie, bei der Antikörper mit Schwermetallionen anstelle von Fluorochromen markiert werden. Die Auslesung erfolgt durch Flugzeit-Massenspektrometrie. Dies ermöglicht die Kombination von viel mehr Antikörperspezifitäten in einer einzigen Probe, ohne dass es zu einem signifikanten Spillover zwischen den Kanälen kommt. Wir verfügen über standardisierte Panels für die Immunphänotypisierung, die Phänotypisierung+intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) und die Phänotypisierung+phospho-CyTOF, jeweils mit 30 bis 38 Antikörpern. Wenden Sie sich für Einzelheiten an [email protected].
Immunphänotypisierung: Unser 33-Antikörper-CyTOF-Panel für die Immunphänotypisierung ist für die Verwendung mit kryokonservierten PBMC konzipiert, kann aber auch für andere Probentypen angepasst werden. Je nach Verfügbarkeit kann eine begrenzte Anzahl zusätzlicher Antikörper zu offenen Kanälen hinzugefügt werden.
Intrazelluläre Zytokine: Unser CyTOF ICS-Panel mit 38 Antikörpern ist in erster Linie auf die Analyse von T-Zell-Reaktionen ausgerichtet. Begrenzte Substitutionen sind möglich (die üblichen sind in der Liste aufgeführt).
Phospho-CyTOF: Unser Phospho-CyTOF-Panel mit 30 Antikörpern kann mit den angegebenen Stimuli verwendet werden, um eine breite Palette von Signalwegen in vielen verschiedenen Zelluntergruppen zu erfassen. Ergänzungen oder Substitutionen in diesem Panel sind schwieriger, da die Oberflächenmarker-Antikörper gut auf fixierte Epitope wirken müssen.
Siehe hier die Liste der Standardantikörper in diesen drei CyTOF-Panels. (überarbeitet Juni 2018)
Ein Video-Interview mit Dr. Mike Leipold zu experimentellen Fragen mit CyTOF finden Sie unter https://www.youtube.com/watch?v=UYYq9jh7FgQ.
Benutzerhinweise
1. Planung des Assays: CyTOF-Assays werden in Stapeln von bis zu 12 Proben durchgeführt. Wenn Sie mehr Proben haben, versuchen Sie bitte, die Chargen nach dem Zufallsprinzip zu verteilen, so dass z. B. Fälle und Kontrollen nicht in getrennten Chargen durchgeführt werden.
2. Sammeln Ihrer Proben: Bitte verwenden Sie ein optimiertes Kryokonservierungsprotokoll für lebensfähige PBMC. Wir empfehlen das Einfrieren von 10^7 Zellen pro Kryoflasche und die Bereitstellung einer Kryoflasche für jeden der oben genannten Assays. PBMC-Verarbeitung und Kryokonservierung sind auch über unsere Blutverarbeitungseinheit erhältlich.
3. Einleiten Ihrer Proben: Eine Online-Bestellung ist erforderlich, bevor die Proben durchgeführt werden können. Die Durchlaufzeit hängt von der Größe Ihres Projekts und der aktuellen Arbeitsbelastung ab; kleinere Projekte können in der Regel innerhalb von 3-4 Wochen nach Auftragserteilung und Probenlieferung abgeschlossen werden.
4. Datenanalyse: Wir bieten eine Standard-Datenanalyse mit der Software FlowJo. Ein Excel-Bericht mit den prozentualen Anteilen aller Gating-Populationen sowie pdf-Dateien mit den Gating-Ergebnissen und allen fcs-Dateien werden über Google Drive bereitgestellt. Bei Standard-Panels werden die Excel-Daten gleichzeitig in unsere Online-Datenbank Stanford Data Miner hochgeladen, wo sie mit anderen HIMC-Daten aus Ihrem Labor sowie mit klinischen/demografischen Daten integriert werden können, sofern diese zur Verfügung gestellt werden. Klicken Sie auf den Hilfe-Link in der oberen linken Ecke der Data Miner-Homepage, um Anweisungen zur Verwendung dieses Systems zu erhalten.
Statistische Beratung erhalten Sie über den HIMC Statistical Consulting Service.
Protokolle
Auf unserer Seite Protokolle finden Sie detaillierte Laborprotokolle sowie kurze Beschreibungen, die sich für Veröffentlichungen oder Förderanträge eignen.
Zusätzliche Informationen:
- Mass Cytometry Review (Trends in Immunology)
- Analyzing CyTOF data in FlowJo