Johnstone arbeitete erstmals 1968 mit Noel Murphy zusammen, wo er auf dem Album Another Round seinen ersten Plattenvertrag erhielt. Bis 1969 hatte sich Johnstone eine regelmäßige Arbeit als Studiomusiker gesichert, wo er begann, verschiedene Musikgenres zu erkunden und mit einer Vielzahl von Instrumenten zu experimentieren. Als 1970 Lyell Tranter (einer der beiden Gitarristen der britischen Akustik-Folk-Gruppe Magna Carta) die Band verließ, nahm Johnstone seinen Platz als Mitglied ein. Er nahm mehrere Alben mit ihnen auf, beginnend 1970 mit Seasons (1970), und trug weiterhin zu Songs from Wasties Orchard (1971) (benannt nach der Straße, in der er in Long Hanborough, Oxfordshire, lebte) und einem Live-Album mit dem Titel In Concert bei.
Während seiner Zeit bei Magna Carta spielte Johnstone eine Vielzahl von Instrumenten, darunter Gitarre, Mandoline, Sitar und Hackbrett. In dieser Zeit wurde auch der Produzent Gus Dudgeon auf ihn aufmerksam. Dudgeon bat Johnstone, auf dem gleichnamigen Soloalbum von Bernie Taupin aus dem Jahr 1971 mitzuspielen, was zu einem Treffen mit Elton John führte und schließlich dazu, dass Johnstone auf Johns Album Madman Across the Water aus dem Jahr 1971 mitspielte, woraufhin er als festes Mitglied in Elton Johns Band aufgenommen wurde. Zuvor bestand die Elton John Band aus John selbst, dem Bassisten Dee Murray und dem Schlagzeuger Nigel Olsson.
Johnstones Debütalbum mit Elton John als festes Mitglied seiner Band war Honky Chateau, auf dem er elektrische und akustische Gitarren, Slide-Gitarre, Banjo und Mandoline spielte und neben Murray und Olsson auch Backing Vocals sang.
1972 arbeitete er mit Joan Armatrading und Pam Nestor an ihrem von Gus Dudgeon produzierten Debütalbum Whatever’s for Us, wobei er bei mehreren Titeln akustische und elektrische Gitarre und bei dem Song „Visionary Mountains“ Sitar spielte.
Johnstone veröffentlichte 1973 ein Soloalbum, Smiling Face, über The Rocket Record Company und gründete eine kurzlebige Band namens China, die 1977 ein gleichnamiges Album veröffentlichte.
Auch wenn er in den späten 1970er und frühen 1980er Jahren an der Seite von Künstlern wie Stevie Nicks, Meat Loaf und Alice Cooper spielte, war Johnstone nie sehr weit von Eltons Projekten entfernt, und seit seiner Wiedervereinigung mit seinen ursprünglichen Bandkollegen Nigel Olsson und Dee Murray für die „Jump Up“-Tour 1982 war er nur noch selten von einem Elton John-Album oder einer Tournee abwesend.
Im Jahr 1990 arbeitete Johnstone zum ersten Mal mit dem Texter Steve Trudell zusammen. Nachdem Musik und Texte standen, gründeten die beiden die Band Warpipes, zu der auch die ehemaligen und aktuellen Elton-John-Bandmitglieder Nigel Olsson am Schlagzeug, Bob Birch am Bass, Guy Babylon an den Keyboards und Billy Trudel als Sänger gehörten. 1991 veröffentlichten Warpipes ihr einziges Album, Holes in the Heavens, auf dem Label Artful Balance Records. Als Artful Balance Records sich auflöste, wurde dieses Album bei Bridge Recordings wiederveröffentlicht. Der Titel des Albums wurde in „Warpipes“ geändert und die Songbesetzung wurde leicht verändert.
1991 produzierte Johnstone Addison Steel’s Stormy Blue, bei dem er Gitarre, Mandoline, Sitar und Banjo spielte und den Gesang übernahm. Co-Produzent Guy Babylon steuerte Keyboard-Arrangements bei, Schlagzeuger Nigel Olsson und Billy Trudell fügten Percussion bzw. Gesang hinzu.
1996 veröffentlichte Johnstone ein Gitarrenlehrvideo mit dem Titel Davey Johnstone: Star Licks Master Sessions for Star Licks Productions, in dem er eine Vielzahl von John-Klassikern spielt, begleitet von Billy Trudell am Gesang und Bob Birch am Bass.
1997, während der Tournee mit John, verbrachten Johnstone und sein damaliger Elton John Bandkollege und ehemaliger Hellecasters-Gitarrist John Jorgenson einen Großteil ihrer freien Zeit mit der Produktion von Crop Circles, einem Album mit akustischen Instrumenten, das 1998 veröffentlicht wurde.
Am 10. Juni 2009 spielte Johnstone die 2000ste Show als Mitglied der Elton John Band im SECC in Glasgow, Schottland. Derzeit fungiert er als Johns musikalischer Leiter, zusätzlich zu seiner Gitarrenarbeit, und spielt zusammen mit Nigel Olsson und John Mahon; er trat auch mit Bob Birch auf, bevor Birch im August 2012 starb.
Im Jahr 2014 spielte er auf „Belle Fleur“ und „If You Were My Love“ von Stevie Nicks‘ Album 24 Karat Gold: Songs from the Vault. Er kannte Nicks, als er auf mehreren Songs ihres Albums Bella Donna von 1981 Gitarre spielte.
Am 1. Oktober 2019 spielte Johnstone seine 3000. Show mit Elton John beim ersten von zwei Farewell Yellow Brick Road Tourstopps im SaskTel Centre in Saskatoon, Saskatchewan.