Die Sanger-Methode dient der Vervielfältigung eines Zielabschnitts der DNA, so dass die DNA-Sequenz genau bestimmt werden kann. Der Einbau von ddNTPs in die Reaktionsventile dient lediglich dazu, die Synthese eines wachsenden DNA-Strangs zu beenden, was zu teilweise replizierten DNA-Fragmenten führt. Dies liegt daran, dass die DNA-Polymerase die 3′-OH-Gruppe der wachsenden Kette und die 5′-Phosphatgruppe des eingehenden dNTPs benötigt, um eine Phosphodiesterbindung herzustellen. Manchmal baut die DNA-Polymerase ein ddNTP ein, und das Fehlen der 3′-OH-Gruppe unterbricht die Kondensationsreaktion zwischen dem 5′-Phosphat (nach der Abspaltung von Pyrophospat) des ankommenden Nukleotids und der 3′-Hydroxylgruppe des vorherigen Nukleotids auf dem wachsenden Strang. Diese Kondensationsreaktion würde normalerweise beim Einbau eines nicht modifizierten dNTP durch die DNA-Polymerase stattfinden. Vereinfacht ausgedrückt, führt der nukleophile Angriff der 3′-OH-Gruppe zur Addition eines Nukleotids an eine wachsende Kette. Das Fehlen der 3′-Hydroxylgruppe hemmt diesen nukleophilen Angriff, so dass die DNA-Polymerase nicht mehr in der Lage ist, ihre Funktion zu erfüllen.
Diese Entdeckung führte zu ihrer passenden Bezeichnung „kettenabschließende Nukleotide“. Die Dideoxyribonukleotide haben keine 3′-Hydroxylgruppe, so dass keine weitere Kettenverlängerung stattfinden kann, sobald sich dieses Dideoxynukleotid an der Kette befindet. Dies kann zu einem Abbruch der DNA-Sequenz führen. Diese Moleküle bilden somit die Grundlage für die Dideoxy-Kettenabbruchmethode der DNA-Sequenzierung, die 1977 von Frederick Sanger und seinem Team als Erweiterung früherer Arbeiten vorgestellt wurde. Sangers Ansatz wurde 2001 als eine der beiden grundlegenden Methoden für die Sequenzierung von DNA-Fragmenten beschrieben (die andere ist die Maxam-Gilbert-Methode), aber die Sanger-Methode ist sowohl die „am weitesten verbreitete als auch die von den meisten automatischen DNA-Sequenzierern verwendete Methode“. Sanger erhielt 1980 seinen zweiten Nobelpreis für Chemie, den er sich mit Walter Gilbert („für ihre Beiträge zur Bestimmung von Basensequenzen in Nukleinsäuren“) und mit Paul Berg („für seine grundlegenden Studien zur Biochemie von Nukleinsäuren, insbesondere im Hinblick auf rekombinante DNA“) teilte, und ging in seinem Nobelvortrag auf die Verwendung von Dideoxynukleotiden ein.
DNA-SequenzierungBearbeiten
Dideoxynukleotide sind nützlich bei der Sequenzierung von DNA in Kombination mit Elektrophorese. Eine DNA-Probe, die in einem Gemisch, das alle vier Desoxynukleotide und ein Didesoxynukleotid enthält, einer PCR (Polymerase-Kettenreaktion) unterzogen wird, erzeugt Stränge, deren Länge der Position jeder Base des Typs entspricht, der den Typ mit dem vorhandenen Didesoxynukleotid ergänzt. Die in der PCR verwendete Taq-Polymerase bevorzugt das ddGNTP, ein Muster, das in verschiedenen Untersuchungen beobachtet wurde. Das heißt, dass jede Nukleotidbase dieses Typs mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit nicht an ein Desoxynukleotid, sondern an ein Didesoxynukleotid gebunden ist, was die Kettenverlängerung beendet. Wenn die Probe dann einer Elektrophorese unterzogen wird, gibt es eine Bande für jede Länge, bei der das Komplement des Dideoxynukleotids vorhanden ist. Heute ist es üblich, fluoreszierende Dideoxynukleotide zu verwenden, so dass jedes der vier Dideoxynukleotide eine andere Fluoreszenz aufweist, die von einem Sequenzierer nachgewiesen werden kann; somit ist nur eine Reaktion erforderlich.