Die Aktivierung von Integrin CD11b steuert die angeborene Anti-Tumor-Immunität

Integrin CD11b reguliert die Makrophagenpolarisierung

Wir haben bereits berichtet, dass der VCAM-Rezeptor Integrin α4β1 die Rekrutierung myeloischer Zellen aus dem Knochenmark in die Mikroumgebung des Tumors fördert und dadurch die Immunsuppression, die Angiogenese und das Fortschreiten des Tumors stimuliert2,13,14,15. Im Gegensatz zu seiner Rolle bei der Regulierung der Rekrutierung myeloischer Zellen in Gewebe während einer akuten Entzündung16,17,18 haben wir festgestellt, dass CD11b (αMβ2), ein Integrin-Rezeptor für ICAM-1 und Fibrinogen, keinen Einfluss auf die Rekrutierung myeloischer Zellen in Tumoren hat, da die globale Deletion von CD11b in Itgam-/- Mäusen keinen Einfluss auf die Anzahl der myeloischen Zellen im Blutkreislauf oder auf die Anzahl der in Tumoren rekrutierten Zellen hat (ergänzende Abbildung 1; ergänzende Abbildung 2a-d). Überraschenderweise stellten wir jedoch fest, dass Integrin CD11b eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Makrophagenpolarisierung spielt. Itgam-/–Makrophagen zeigten eine verstärkte immunsuppressive Gen- und Proteinexpression und eine stark reduzierte pro-inflammatorische Gen- und Proteinexpression im Vergleich zu WT-Makrophagen, unabhängig davon, ob sie unter basalen, IL-4- oder IFNγ/LPS-Stimulationsbedingungen stimuliert wurden (Abb. 1a, ergänzende Abbildung 2e-f). Um festzustellen, ob CD11b auch die Makrophagenpolarisation in vivo reguliert, isolierten und charakterisierten wir F4/80 + TAMs aus LLC-Tumoren, die in Itgam-/- und WT-Mäusen gewachsen waren. Wir fanden heraus, dass Itgam-/- TAMs auch signifikant höhere Mengen an mRNAs exprimierten, die mit Immunsuppression und Angiogenese assoziiert sind, wie Arg1, Tgfb, Il10, Il6 und Pdgfb, und eine signifikant niedrigere Expression von Genen, die mit Immunstimulation assoziiert sind, wie Ifng, Nos2 und Tnfa, als WT TAMs (Abb. 1b, ergänzende Abbildung 2g). 1b, ergänzende Abbildung 2g).

Wichtig ist, dass ein vorübergehender siRNA-vermittelter Knockdown von CD11b in in vitro kultivierten Makrophagen die immunsuppressive Genexpression erhöhte und die immunstimulierende Genexpression verringerte, Effekte, die mit der CD11b-Deletion vergleichbar sind (Abb. 1c), was darauf hindeutet, dass sogar ein vorübergehender Verlust von CD11b die immunsuppressive Genexpression von Makrophagen kontrolliert. Um zu klären, ob die CD11b-Expression oder -Funktion die Makrophagen-Genexpression steuert, untersuchten wir die Wirkung von hemmenden CD11b-Antikörpern auf die mRNA-Expression von Makrophagen. Die Blockade der CD11b-vermittelten Anheftung von Mausmakrophagen an ICAM-1-beschichtete Substrate durch neutralisierende Anti-CD11b-Antikörper führte ebenfalls zu einer immunsuppressiven mRNA-Expression in Makrophagen (Abb. 1d). In ähnlicher Weise förderte die Anheftung von Makrophagen an das Integrin α4β1-Substrat VCAM-1 oder der Verlust der Anheftung durch Suspensionskultur die immunsuppressive Transkription bei Mäusen und Menschen, während die Anheftung an ICAM-1-beschichtete Oberflächen die immunstimulierende Transkription förderte (Abb. 1e, f, ergänzende Abbildung). 1e, f, ergänzende Abbildung 1h), was darauf hindeutet, dass die Ligatur von CD11b die immunstimulierende Makrophagen-Transkription steuert.

Der Verlust der pro-inflammatorischen Zytokinexpression in Itgam-/–Makrophagen deutet darauf hin, dass CD11b die Aktivierung von pro-inflammatorischen Transkriptionsfaktoren wie NFκB regulieren könnte. Wir stellten fest, dass Itgam-/–Makrophagen im Vergleich zu WT-Makrophagen als Reaktion auf die LPS-Stimulation eine verringerte NFκB-Serin-536-Phosphorylierung (ein Hinweis auf eine verringerte Aktivierung19) aufwiesen, was darauf hindeutet, dass CD11b eine Rolle bei der NFκB-Aktivierung spielt (Abb. 1g). Da andere Studien CD11b in die Förderung pro-inflammatorischer Reaktionen von Monozyten und dendritischen Zellen durch direkte Interaktionen von LPS mit extrazellulären Integrin-beta2-Domänen einbezogen haben20,21, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass CD11b-Aktivierung und -Signalisierung eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Makrophagenpolarisierung in vitro und in vivo spielen.

Makrophagen-CD11b reguliert das Tumorwachstum

Unsere Daten zeigen, dass Itgam-/–Makrophagen aus dem Knochenmark und tumorassoziierte Makrophagen mehr immunsuppressive Transkriptionsprofile aufweisen als WT-Makrophagen. Um festzustellen, ob sich dieser Unterschied auf das Tumorwachstum auswirkt, haben wir WT- oder Itgam-/–Makrophagen aus dem Knochenmark oder tumorassoziierte Makrophagen mit Tumorzellen adoptiv in WT- oder Itgam-/–Mäuse übertragen. Zuvor hatten wir gezeigt, dass adoptiv übertragene, immunsuppressive BMDM oder TAM das Tumorwachstum stimulieren können9,10. Bemerkenswerterweise stimulierten aus dem Knochenmark stammende Itgam-/–Makrophagen (Abb. 1h) sowie aus dem Tumor stammende Itgam-/–Makrophagen (Abb. 1i) das Tumorwachstum im Vergleich zu WT-Makrophagen sowohl in WT- als auch in Itgam-/–Mäusen stark. Da Itgam-/–Makrophagen ein immunsuppressives Transkriptionsprofil aufweisen (Abb. 1b) und von Itgam-/–Mäusen stammende Tumoren ein insgesamt immunsuppressives Transkriptionsprofil aufweisen (Abb. 1j), legen diese Daten nahe, dass die CD11b-Expression oder -Aktivierung das gesamte Tumorwachstum beeinflussen könnte. Tatsächlich stellten wir fest, dass subkutane (LLC), orthotope (Melanom) und autochthone (PyMT) Tumore in Itgam-/–Mäusen aggressiver wuchsen als in WT-Mäusen (Abb. 1k). Da Itgam-/–Mäuse wesentlich mehr CD4 + Foxp3 + Tregs und weniger CD8+ T-Zellen in den Tumoren aufwiesen als WT-Mäuse (ergänzende Abbildung 3a-b), stützen unsere Studien die Schlussfolgerung, dass CD11b eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der gesamten Immunantwort in Tumoren spielt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Isoleucin 332 im CD11b-Molekül als allosterischer Schalter dient, der die Aktivierung und Form des Adhäsionsrezeptors steuert22. Um festzustellen, ob die CD11b-Aktivierung die Tumorentwicklung steuert, haben wir einen konstitutiv aktivierten CD11b-Knockin-Mausstamm (C57BL/6 ITGAMI332G) durch Einführung einer I332G-Punktmutation in das Itgam-Gen der Maus erzeugt. I332G-Knockin-Mäuse exprimieren sowohl auf Monozyten als auch auf Granulozyten normale Mengen an CD11b auf der Zelloberfläche und weisen normale Mengen an allen Blutzellen auf (ergänzende Abbildung 3c-d). In vitro-Adhäsionstests mit Makrophagen aus dem Knochenmark dieser Mäuse zeigten, dass I332G-Zellen konstitutiv aktives CD11b exprimieren (ergänzende Abbildung 3e). Wichtig ist, dass I332G Itgam-Knockin-Mäuse ein deutlich reduziertes LLC-Tumorwachstum aufwiesen (Abb. 1k). Während also die Deletion von CD11b eine entzündungshemmende Makrophagenpolarisierung stimuliert, die Rekrutierung von CD8+ T-Zellen hemmt und das Tumorwachstum fördert, hemmt die Aktivierung von CD11b das Tumorwachstum. Diese Studien deuten darauf hin, dass CD11b in Makrophagen eine entscheidende funktionelle Rolle bei der Kontrolle des Tumorwachstums spielt.

Immunsuppressive Signale hemmen die CD11b-Expression

Um festzustellen, ob Signale, die mit der Mikroumgebung des Tumors in Verbindung stehen, die CD11b-Expression verändern und in der Folge die Polarisierung der myeloischen Zellen beeinflussen können, haben wir die Wirkung von Makrophagenmedien (mCSF-, IL-4- und IFNγ/LPS) auf die CD11b-Expression an der Zelloberfläche von Makrophagen aus dem Knochenmark untersucht. Während das immunsuppressive Zytokin IL-4 die CD11b-Expression reduzierte, erhöhten die pro-inflammatorischen Stimuli IFNγ/LPS die CD11b-Oberflächenexpression im Vergleich zu den Werten, die auf mCSF-stimulierten Makrophagen exprimiert wurden (ergänzende Abbildung 4a-b). Darüber hinaus hemmte der immunsuppressive Faktor TGFβ, aber nicht IL-10, die CD11b-Oberflächenexpression (ergänzende Abbildung 4c); TGFβ, IL-4 und tumorzellkonditioniertes Medium (TCM) unterdrückten jeweils auch die Cd11b-mRNA-Expression (ergänzende Abbildung 4d). Wichtig ist, dass TGFβ und TCM die CD11b-Zelloberflächenexpression reduzierten und die immunsuppressive Transkription stimulierten, während sie die immunstimulierende Transkription in einer Weise hemmten, die durch den TGFβR1-Inhibitor SB525334 umgekehrt wurde (ergänzende Abbildung 4e-g). Diese Daten deuten darauf hin, dass Zytokine wie TGFβ in der Tumormikroumgebung die CD11b-Expression oder -Aktivierung unterdrücken und dadurch die immunsuppressive Makrophagenpolarisierung fördern.

Makrophagen CD11b reguliert die Stabilität der Blutgefäße

Makrophagen kontrollieren nicht nur die Immunantwort, sondern auch die Angiogenese und Desmoplasie, indem sie Zytokine wie VEGF-A und PDGF-BB exprimieren, Wachstumsfaktoren, die die Endothelzellen und die glatten Muskeln/Perizyten der Gefäße während der Angiogenese regulieren2. Tumorblutgefäße bestehen oft aus einer einzigen Endothelschicht ohne unterstützende Perizyten oder glatte Muskelzellen; diese Blutgefäße sind in Tumoren zahlreicher als in normalem Gewebe, aber sie sind anormal geformt und schlecht durchblutet. Im Gegensatz dazu sind die Blutgefäße in Tumoren mit einem hohen Verhältnis von PDGF zu VEGF von Perizyten ausgekleidet, mesenchymalen Zellen, die die Gefäße stabilisieren und die Durchblutung des Tumors verbessern23,24,25,26,27. Diese Tumore wachsen schneller als Tumore mit einem geringeren PDGF-VEGF-Verhältnis, sprechen aber aufgrund der besseren Tumordurchblutung auch besser auf Chemo- und Immuntherapie an24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Da Itgam-/–Makrophagen eine hohe PDGF- und eine niedrige VEGF-Genexpression aufwiesen (Abb. 1a, b), untersuchten wir die Muster der Blutgefäßentwicklung in Itgam-/– und WT-Tumoren. Eine Bewertung der Gefäßmuster in LLC- und PyMT-Tumoren von WT- und Itgam-/–Mäusen zeigte, dass Itgam-/–Tumoren weniger, längere Blutgefäße mit breiteren Lumen und weniger Verzweigungspunkten/Feld als WT-Tumoren aufwiesen (Abb. 2a, b; ergänzende Abbildung 5a). Itgam-/–Tumoren hatten mehr Blutgefäße, die mit Desmin+, NG2+ oder SMA+ Perizyten/Glattmuskelzellen ausgekleidet waren als WT-Tumoren (Abb. 2a-c; ergänzende Abbildung 5b). Dementsprechend waren diese Gefäße in Itgam-/–Mäusen weniger durchlässig als in WT-Mäusen, da weniger intravaskuläres FITC-Dextran in das Tumorparenchym austrat (Abb. 2a-d). Diese Daten deuten darauf hin, dass das Integrin CD11b eine Rolle bei der Steuerung der Blutgefäßreifung spielt. Wir stellten fest, dass die Genexpression von PDGF-BB, nicht aber von VEGF-A, in den Tumoren stark erhöht war (Abb. 2e; ergänzende Abbildung 5c). Wichtig ist, dass auch die Proteinexpression von PDGF-BB in Itgam-/–Tumoren und in vom Tumor stammenden Makrophagen im Vergleich zu WT-Tumoren erhöht war (Abb. 2f). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass Makrophagen-CD11b die Tumorvaskularisierung durch die konstitutive Expression erhöhter PDGF-Werte kontrolliert.

Zur Unterstützung dieser Beobachtungen zur Rolle von CD11b bei der Neovaskularisierung stellten wir fest, dass Itgam-/–Mäuse einen gut entwickelten retinalen Gefäßplexus aufweisen (Abb. 2g, Isolectin B+, grün) bei der Geburt (P1) aufwiesen, verglichen mit WT-Mäusen, die eine unterentwickelte retinale Vaskulatur aufweisen, die sich vom ersten postnatalen Tag (P1) bis zum 9. Der oberflächliche Gefäßplexus war bei Itgam-/- Mäusen vom postnatalen Tag P1 bis zum postnatalen Tag P9 stärker entwickelt als bei WT-Neugeborenen (Abb. 2g). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Makrophagen und CD11b eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der normalen Gefäßentwicklung spielen.

Um zu untersuchen, ob erhöhtes PDGF-BB für die verstärkte Gefäßreifung und das Tumorwachstum in Itgam-/–Mäusen verantwortlich ist, behandelten wir WT- und Itgam-/–Mäuse mit LLC-Tumoren mit Imatinib, einem Inhibitor des PDGF-BB-Rezeptors PDGFR1. Die Behandlung mit Imatinib unterdrückte das in Itgam-/–Mäusen beobachtete verstärkte Tumorwachstum (Abb. 2h, i). Außerdem erhöhte es die Gefäßdichte und unterdrückte die Normalisierung der Gefäße in Itgam-/- Mäusen (Abb. 2h, i). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse das Konzept, dass Integrin CD11b die Gefäßentwicklung durch die Kontrolle der PDGF-BB-Expression moduliert.

CD11b reguliert die Let7a- und c-Myc-Expression

CD11b kann die entzündungshemmende Makrophagenpolarisierung durch die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie Stat3 steuern, die die Expression von immunsuppressiven und pro-angiogenen Faktoren wie Arginase 1, Myc und VEGF fördern können37,38,39. Itgam-/–Makrophagen weisen konstitutiv phosphoryliertes Stat3 auf (Abb. 3a); die hohe Expression immunsuppressiver Faktoren in Itgam-/–Makrophagen wurde durch Behandlung mit dem Stat3-Inhibitor 5,15-DPP auf das Niveau von WT-Makrophagen reduziert (Abb. 3a). Überraschenderweise hatte die Stat3-Inhibition jedoch keinen Einfluss auf die hohe Il6-Expression, die in Itgam-/–Makrophagen beobachtet wurde (Abb. 3a). Wichtig ist, dass IL-6 Stat338 direkt aktivieren kann. Wir fanden heraus, dass IL-6 das gleiche Muster der immunsuppressiven Polarisierung in myeloischen Zellen und Makrophagen von Mäusen und Menschen fördert, das wir bei Itgam-/–Makrophagen beobachtet haben (Abb. 3b). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass autokrines IL6 die konstitutiv immunsuppressive Polarisierung in Itgam-/–Makrophagen vorantreiben kann. Zur Unterstützung dieses Konzepts verringerte der Knockdown von Il6 die Expression der konstitutiven Pdgfb-Expression in Itgam-/–Makrophagen (Abb. 3c). Da TAMs eine Hauptquelle für die Il6-Expression in Tumoren sind15, deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CD11b als natürliche Bremse für die Immunsuppression dient, zum Teil durch die Kontrolle der Transkription von Il6 durch myeloische Zellen.

Die Let7-Familie von microRNAs kann die Il6-Expression in Tumor- und Entzündungszellen kontrollieren40,41. microRNAs sind nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression auf der post-transkriptionellen Ebene modulieren, indem sie die RNA-Translation oder -Stabilität beeinträchtigen, und die die Immunsuppression und Angiogenese von Tumoren erheblich beeinflussen können42,43. Wir fanden heraus, dass die Expression der miRNA Let7a umgekehrt mit der Expression von Il6 in murinen und menschlichen Makrophagen korreliert (ergänzende Abbildung 6a-b). Daher fragten wir, ob der Verlust der CD11b-Expression in Makrophagen die Let7a-Expression beeinflusst. Die Let7a-Expression wurde in Itgam-/- und Itgam-siRNA-transduzierten Makrophagen und in Gegenwart von neutralisierenden CD11b-Antikörpern (Abb. 3d; ergänzende Abbildung 6c) auf eine Weise reduziert, die unabhängig von Lin28 war, einem RNA-bindenden Protein, das Let7 spaltet und inaktiviert, da die Lin28-Konzentrationen nicht von der CD11b-Expression oder -Aktivierung beeinflusst wurden (ergänzende Abbildung 6b, d-e). Die Ligation von CD11b durch ICAM-1 förderte die zeitabhängige Let7a-Expression, während die Il6-Expression gehemmt wurde; umgekehrt hemmte die Unterdrückung der Adhäsion die Let7a-Expression und förderte die Il6-Expression sowohl in murinen als auch in menschlichen Makrophagen (Abb. 3e, f). Wichtig ist, dass die ektopische Expression der miRNA Let7a (pre-miRNA) die immunsuppressive Genexpression hemmte und die pro-inflammatorische Genexpression in Itgam-/–Makrophagen stimulierte, während die anti-miRNA Let7a die immunsuppressive Genexpression stimulierte und die immunstimulierende Genexpression in WT-Makrophagen hemmte (Abb. 3g). Ähnlich wie bei der CD11b-Ablation (Abb. 1a) stimulierte die anti-miRNA Let7a die Pdgfb-Expression, hatte aber keinen Einfluss auf die Vegfa-Expression (Abb. 3h). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die CD11b-Aktivierung die Expression der miRNA Let7a fördert, die wiederum die IL6-vermittelte immunsuppressive Makrophagengenexpression hemmt.

c-Myc, ein Transkriptionsfaktor, der die immunsuppressive Makrophagenpolarisierung reguliert, bindet an den Let7-Promotor und unterdrückt dessen Transkription; interessanterweise kann Let7 auch die c-Myc-Expression unterdrücken44,45. Wir fanden heraus, dass das c-Myc-Gen in Itgam-/–Makrophagen im Vergleich zu WT-Makrophagen hochreguliert war (Abb. 3i). Auch die c-Myc-Proteinexpression und die Serin-62-Phosphorylierung, die den Transkriptionsfaktor stabilisiert46, waren in Itgam-/–Makrophagen im Vergleich zu WT-Makrophagen hochreguliert (Abb. 3j). Anschließend fragten wir, ob die Hemmung der cMyc-Funktion die Let7-Expression fördern und dadurch die Makrophagenpolarisation verändern könnte. Bemerkenswert ist, dass die Expression von Let7a, Let7d und Let7f in Itgam-/–Makrophagen reduziert war; eine pharmakologische Hemmung von c-Myc stellte jedoch die Let7-Expression in Itgam-/–Makrophagen wieder her und kehrte die erhöhte immunsuppressive Genexpression von Itgam-/–Makrophagen um (Abb. 3k, l). Diese Daten deuten darauf hin, dass Integrin CD11b die Myc-Expression und die immunsuppressive Makrophagenpolarisation in Abhängigkeit von Let7 unterdrückt.

Da Let7a die Makrophagen-vermittelte Pdgfb-Expression hemmt, untersuchten wir die Wirkung der Let7a-Expression auf die Neovaskularisation in vitro und in vivo. Endothelzellen und vaskuläre glatte Muskelzellen, die an Mikroträgerkügelchen gebunden waren, wurden in Fibringelen kultiviert, die entweder WT- oder Itgam-/–Makrophagen enthielten, die mit Kontroll-miRNA, pre-miRNA Let7a, anti-miRNA Let7a oder Pdgfb-bb siRNA transduziert waren. Itgam-/–Makrophagen stimulierten die Sprossverlängerung, die durch Transduktion von Makrophagen mit Let7a miRNA oder Pdgfb siRNA gehemmt wurde (Abb. 4a, b; ergänzende Abbildung 6f). Im Gegensatz dazu stimulierte die Expression der anti-miRNA Let7a in WT-Makrophagen, nicht aber in Itgam-/–Makrophagen, die Sprossverlängerung (Abb. 4a, b; ergänzende Abbildung 6f). Darüber hinaus stimulierten mit anti-miR Let7a transduzierte Makrophagen die Bildung von reifen, mit Perizyten beschichteten Blutgefäßen in bFGF-gesättigtem Matrigel in vivo (Abb. 4c). Zusammengenommen zeigen diese Studien, dass CD11b die Neovaskularisierung durch die Regulierung von Let7a und die anschließende PDGF-BB-Expression steuert.

Myeloide Zelle Let7a reguliert Tumorprogression

Um die Rolle von Let7a bei der Regulierung von Tumorimmunsuppression und Neovaskularisierung zu testen, verabreichten wir anti-miR Let7a, haben wir anti-miR Let7a in Form von Nanopartikeln, die auf myeloische Zellen abzielen, in vivo in den Tumor eingebracht (Abb. 4d). Wir fanden heraus, dass Integrin αvβ3-gerichtete Nanopartikel spezifisch von zirkulierenden myeloischen Zellen in normalen und tumortragenden Tieren aufgenommen wurden (ergänzende Abbildung 7a-h). Die Verabreichung von anti-miRNA Let7a stimulierte das Wachstum von LLC-Tumoren, vergleichbar mit dem in Itgam-/- Mäusen beobachteten Wachstum (Abb. 4d). Obwohl Let7a in immunen und nicht-immunen Zellen in Tumoren exprimiert wird, stellten wir fest, dass die Verabreichung von anti-miR Let7a nur die Let7a-Expression in zirkulierenden Monozyten und in tumorassoziierten Makrophagen hemmte, nicht aber in anderen tumorassoziierten Zellen (Abb. 4e). Wichtig ist, dass anti-miRNA Let7a die immunsuppressive und pro-angiogene Genexpression stimulierte und die pro-inflammatorische Genexpression in Tumoren im Vergleich zu Kontrollen hemmte (Abb. 4f, ergänzende Abbildung 8a). Anti-miRNA Let7a stimulierte auch die Normalisierung der Blutgefäße in transfizierten Tumoren, da die Gefäße länger, weniger verzweigt, stark mit Perizyten bedeckt und weniger undicht waren als die Gefäße von transfizierten Kontrolltumoren (Abb. 4g, h). Wichtig ist, dass Anti-Let7a auch die Rekrutierung von CD8+ T-Zellen in Tumoren unterdrückte und die Rekrutierung von CD4+ T-Zellen in Tumoren verstärkte (Abb. 4i). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass CD11b die Immunsuppression und die vaskuläre Reifung durch die Regulierung der miRNA Let7a hemmt. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine verstärkte vaskuläre Normalisierung in Tumoren die Tumordurchblutung verbessern und das Ansprechen auf die Therapie fördern kann23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Um festzustellen, ob die durch die anti-miRNA Let7a induzierte vaskuläre Normalisierung die Wirksamkeit der Chemotherapie durch Verbesserung der Tumordurchblutung erhöhen könnte, behandelten wir Mäuse mit LLC-Tumoren mit gezielter Verabreichung der anti-miRNA Let7a oder einer Kontroll-miRNA in Kombination mit Chemotherapie (Gemcitabin) (Abb. 4j). Während die anti-miRNA Let7a das Wachstum des LLC-Tumors förderte, reduzierte die anti-miRNA Let7a in Kombination mit Gemcitabin das Tumorwachstum erheblich, was mit der Vorstellung übereinstimmt, dass die Hemmung von Let7a die Zugänglichkeit des Tumors für die Chemotherapie erhöht (Abb. 4k). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen stellten wir fest, dass die Gemcitabin-Behandlung von Itgam-/–Mäusen das Tumorwachstum stärker unterdrückte als die Gemcitabin-Behandlung von WT-Mäusen (ergänzende Abbildung 8b). Da Itgam-/–Mäuse eine bessere Durchblutung (weniger Gefäßlecks) als WT-Mäuse aufwiesen (ergänzende Abbildung 8c), deuten diese Studien darauf hin, dass CD11b durch seine Wirkung auf die miRNA Let7a eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Immun- und Gefäßreaktionen von Tumoren spielt.

Der CD11b-Agonist LA1 hemmt das Tumorwachstum

Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine gezielte pharmakologische Aktivierung von CD11b in vivo tumorassoziierte Makrophagen repolarisieren könnte, was zu einer Hemmung der Tumorimmununterdrückung und des Tumorwachstums führt. Wir untersuchten daher die Auswirkungen eines niedermolekularen Agonisten von CD11b, Leukadherin 1 (LA1)47,48 (Abb. 5a), auf die Makrophagenpolarisierung und das Tumorwachstum. LA1 stimulierte die Adhäsion myeloischer Zellen an ICAM-1-beschichtete Substrate in einer Weise, die durch Anti-CD11b-neutralisierende Antikörper gehemmt wurde (Abb. 5b). LA1 stimulierte die Genexpression der Makrophagen-Immunantwort, was sich in einer Zunahme der Expression der mRNAs Il1b, Tnfa, Il12, Nos2 und Ifng zeigte (ergänzende Abbildung 9a). Da LA1 die Expression von Let7a stimulierte und die Expression von Pdgfb und Il6 hemmte (Abb. 5c), deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass LA1 proinflammatorische Immunantworten stimulieren könnte, die das Tumorwachstum in vivo hemmen könnten. Um die Auswirkungen von LA1 auf tumorassoziierte Makrophagen in vivo zu beurteilen, wurden tumorassoziierte Makrophagen isoliert10, zuvor mit LA1 behandelt und mit LLC-Tumorzellen ko-implantiert. Mit LA1 behandelte Makrophagen hemmten das Tumorwachstum vollständig (Abb. 5d, e), obwohl LA1 keine direkte Wirkung auf die Lebensfähigkeit von LLC oder Makrophagen hatte (Abb. 5e, f). Obwohl LA1 keine Wirkung auf das Wachstum von CL66-Luc-Brusttumorzellen in vitro hatte (ergänzende Abbildung 9b), reduzierte LA1 das Tumorwachstum in syngenen, orthotopisch implantierten CL66-Luc-Brusttumoren wirksamer als Taxol (Abb. 5g). LA1 wirkte auch synergistisch mit Bestrahlung, um das Wachstum von CL66-Luc-Brusttumoren zu unterdrücken (Abb. 5h), und unterdrückte das Wachstum von orthotopen, menschlichen MDA-MB-231-Mammaria-Xenograft-Tumoren (Abb. 5i). Wichtig ist, dass LA1 das Wachstum des Lungentumors der Maus LLC in WT-, aber nicht in Itgam-/- Mäusen hemmte, was darauf hindeutet, dass LA1 über das Integrin CD11b wirkt, um das Wachstum von Tumoren zu unterdrücken (Abb. 5j, k).

Da die LA1-Behandlung die Anwesenheit von MHC-II+ Makrophagen, die typischerweise als immunkompetent gelten, erhöhte und die Anwesenheit von CD206+ Makrophagen, die typischerweise als immunsuppressiv gelten, in LLC- und CL66-Luc-Tumoren verringerte (ergänzende Abbildung 9c-d), deuten unsere Studien darauf hin, dass LA1 tumorassoziierte Makrophagen repolarisiert. Dementsprechend stellten wir fest, dass LA1 die Expression von S100A8 und MMP9 in CD11b+-Zellen in LLC-Tumoren hemmte und auch die Expression von Arginase1, S100A8 und MMP9 in CL66-Luc-Tumoren hemmte (ergänzende Abbildung 9e-f). Da es sich bei diesen Proteinen um Marker für pro-tumorale Makrophagen handelt, deuten diese Studien darauf hin, dass LA1 wahrscheinlich das Tumorwachstum hemmt, indem es tumorassoziierte Makrophagen repolarisiert. In der Tat erhöhte die LA1-Behandlung die Präsenz von CD8 + T-Zellen sowohl in LLC- als auch in CL66-Luc-Tumoren (ergänzende Abbildung 10a-c). Wir beobachteten auch, dass die LA1-Behandlung die Neovaskularisierung in den Tumoren veränderte, indem sie die Anzahl der SMA + Blutgefäße verringerte (Abb. 5l). Durch die Verstärkung des pro-inflammatorischen Immunprofils von Tumoren und die Hemmung der Gefäßnormalisierung in Tumoren veränderte der niedermolekulare CD11b-Agonist LA1 signifikant die Makrophagenpolarisierung, erhöhte die Rekrutierung von CD8+ T-Zellen in Tumoren und hemmte die Tumorprogression in Mausmodellen von Mäuse- und Humankrebs.