Die Tierpol-Domäne des Seeigels ist ein Six3-abhängiges neurogenes Musterungszentrum | Entwicklung

ERGEBNISSE

Identifizierung von regulatorischen Genen für die Tierpol-Domäne (APD)

Um den frühen regulatorischen Zustand der APD im Seeigel-Embryo zu definieren, haben wir gleichzeitig bioinformatische und experimentelle Ansätze verwendet, um Gene zu identifizieren, die für regulatorische Proteine kodieren, die im Thisterritorium vor der Gastrulation ausgedrückt werden. Der bioinformatische Ansatz nutzte die Bemühungen unseres Labors (Burke et al., 2006) und anderer (Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Materna et al., 2006; Tu et al., 2006) um die Annotation von Genomsequenzen, die die APD-Expressionsmuster zahlreicher Gene dokumentierten, die für Transkriptionsfaktoren kodieren und/oder Orthologe von Faktoren sind, von denen bekannt ist, dass sie im neuralen Gewebe von Embryonen anderer Arten funktionieren. Der experimentelle Ansatz verglich die Repräsentation von RNAs in Δcadherin-mRNA-injizierten mit normalen Embryonen im Blastula-Stadium des Schlüpfens. Embryonen, denen das nukleäreβ-Catenin fehlt, bestehen fast ausschließlich aus dem Tierpol-Ektoderm, wie die Expressionsmuster von foxq2 und hbn zeigen. In normalen Embryonen sind diese mRNAs ab dem Blastula-Stadium auf den Tierpol beschränkt (Burke et al., 2006; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008) und die Bereiche ihrer Expression im Mesenchym-Blastula-Stadium überlappen sich am Tierpol (Abb. 1B-D). Im weiteren Verlauf der Entwicklung durch die Gastrulation bildet der Bereich derhbn -Expressionszellen einen Ring, der diefoxq2 -Expressionszellen umgibt (Abb. 1F). Wenn die kanonische Wnt-, Nodal- und BMP-Signalisierung durch ΔcadherinmRNA-Injektion ausgeschaltet wird, exprimiert die tierische Hälfte des Embryos foxq2, während der größte Teil des restlichen Embryos hbn exprimiert (Abb. 1H). Diese Muster deuten darauf hin, dass Embryonen, denen die kanonische Wnt- und Nodal-BMP2/4-Signalgebung fehlt, fast vollständig aus einer dramatisch erweiterten APD bestehen, deren äußere Grenzen durch die hbn-Expression definiert werden. Foxq2- und hbn-Transkripte erscheinen in der APD während der späten Spaltphase/frühen Blastula-Stadien, was darauf hindeutet, dass die Spezifikation der APD zumindest zu diesem Zeitpunkt erfolgt.

Um frühe APD-regulierende Gene zu identifizieren, verglichen wir die relativen Konzentrationen einzelner mRNAs in Δcadherin-mRNA- gegenüber Glycerin-injizierten Embryonen im Stadium der schlüpfenden Blastula unter Verwendung eines Microarrays, das alle in der Seeigel-Genomsequenz gefundenen Genvorhersagen repräsentiert (Wei et al., 2006). Dieses Stadium markiert den Übergang zwischen der Spaltung und dem Beginn der Morphogenese und liegt kurz nach dem Zeitpunkt, an dem die frühesten Marker für die APD entdeckt wurden (Burke et al., 2006;Howard-Ashby et al., 2006a;Howard-Ashby et al., 2006b;Tu et al., 2006;Yaguchi et al., 2008). Es wurde eine Reihe von Genen identifiziert, die für Transkriptionsfaktoren und Komponenten von Signalwegen kodieren und deren Expression in zwei Chargen von mit Cadherin-mRNA injizierten Embryonen durchschnittlich mindestens dreifach erhöht war. Diese überschnitten sich teilweise mit der Gruppe von Kandidatengenen, die durch den bioinformatischen Ansatz identifiziert wurden. Die kombinierten Sätze enthalten 27 Gene und bilden einen vorläufigen APD-regulatorischen Gensatz (E-APD) (Tabelle 1).

Um die am frühesten exprimierten Gene innerhalb des E-APD-Sets zu identifizieren, untersuchten wir die von Microarrays erzeugten zeitlichen Expressionsprofile wie zuvor beschrieben (Wei et al, Die Muster wurden durch Vergleich mit veröffentlichten Daten (Burke et al., 2006; Croce et al., 2006; Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Materna et al., 2006; Sweet et al., 2002; Takacs et al., 2004; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008) und durch unsere In-situ-Hybridisierungen (unsere unveröffentlichten Beobachtungen) überprüft.) Die Gene wurden in drei Gruppen eingeteilt: diejenigen, die in der väterlichen RNA-Population am stärksten vertreten waren (Abb. 2A), diejenigen, die während der Spaltphase stark hochreguliert waren (Abb. 2B, C) und diejenigen, die zwischen der späten Spaltphase und dem frühen Gastrula-Stadium hochreguliert waren (Abb. 2D). Wir konzentrierten uns zunächst auf die Mitglieder der frühen embryonalen Expressionsgruppe. Wie unten gezeigt, identifizierten wir mit Hilfe von Verlust- und Verstärkungsfunktionstests ein Sp-Six3 (im Folgenden Six3), das an oder nahe der Spitze der APD-Genexpressionshierarchie steht.

Six3 wird früh in der APD exprimiert

Die Identifizierung von Seeigel-Six3 ist eindeutig, da seine Sequenz in der Homöodomäne (98% identisch mitHsSix3), der Six-Domäne (91%) und der Groucho-Interaktionsdomäne (71%) sehr hoch konserviert ist (sieheAbbildung S1 im Zusatzmaterial). Wir bestätigten frühere Studien, die zeigten, dass Six3 in einem dynamischen Muster während der Entwicklung von Paracentrotus lividus (Poustka etal., 2007) exprimiert wird, einer Art, die eng mit dem in dieser Studie verwendeten Strongylocentrotuspurpuratus verwandt ist. Die wichtigsten Merkmale sind, dass die Six3-Transkripte während der späten Keimbildung in der tierischen Hemisphäre exprimiert werden (Abb. 3A), im APD bis zum Stadium der geschlüpften Blastula (Abb. 3B) und dann in zwei Ringen (Abb. 3G,H), einer in der Nähe der Peripherie des APD (Abb. 3C-F,H) und der andere im Endomesoderm (Abb. 3C-G), während der Blastula-Stadien des Mesenchyms. Während der Gastrulation wird Six3 in einigen sekundären Mesenchymzellen, die im gesamten Blastocoel und an der Spitze des Archenterons verstreut sind (Abb. 3I, Pfeil), wie von Howard-Ashby et al. berichtet (Howard-Ashby et al., 2006b), in Zellen im Tierpol (Abb. 3I,J) und im oralen Ektoderm (Abb. 3J,K) exprimiert. Im Pluteus-Stadium wird Six3-RNA in zwei Zellclustern, die den Mund flankieren (Abb. 3K, Pfeile), und im Bienenstockband (Abb. 3K) nachgewiesen.

Die Gesamtkonzentration der Six-mRNA im frühen Blastula-Stadium des Mesenchyms ändert sich nicht signifikant nach der Injektion von Δcadherin-mRNA (Tabelle 1). In-situ-Hybridisierungen stimmen mit diesem Ergebnis überein und zeigen, dass sich die Verteilung in Δcadherin-mRNA-injizierten Embryonen unterscheidet, indem sie in den vegetativen Zellen fehlt und die breite tierische Hemisphären-Expression beibehält, die vor der Restriktion durch von kanonischem Wnt abhängige Prozesse etabliert wird (siehe Abb. S2 im Zusatzmaterial).

Die Funktion von Six3 ist für die APD-Bildung und die Differenzierung von Neuronen erforderlich

Um die Funktion von Six3 zu testen, injizierten wir befruchteten Eiern zwei verschiedene Morpholinos, die die Six3-Translation blockierten und jeweils die gleichen Entwicklungsdefekte auslösten. Die Embryonen nahmen nach 3 Tagen eine rundliche Morphologie an (Abb. 4A, B), und die Spicula waren entweder reduziert oder fehlten. Dem Ektoderm des Tierpols fehlte die verdickte Epithelmorphologie, die für die Tierplatte charakteristisch ist (Abb. 4, vergleiche A,B mit C,Klammern). In einigen Embryo-Chargen verlief die Gastrulation normal, wenn auch verzögert, und die Position des Archenterons zeigte, dass die orale/aborale Polarität etabliert war (Abb.4A). In anderen Chargen exogastrulierten die meisten Embryonen. Bei Embryonen, denen Six3 fehlte, war die neurale Differenzierung stark gehemmt, wie durch Immunfärbung für neurale Marker, die normalerweise während der Lategastrula- und Pluteusstadien exprimiert werden, nachgewiesen wurde (Abb. 4, vergleiche A, B mit C). Die Mehrheit (2/3) der Embryonen enthielt noserotonerge Neuronen, und die übrigen wiesen eine reduzierte Anzahl auf (Abb. 4D), verglichen mit der normalen Anzahl in diesem Stadium (3-5). Das Gleiche galt für alle anderen Neuronen, die mit dem pan-neuralen Marker Synaptotagmin (1e11) gemessen wurden (Abb. 4A,B) und die in der APD und dem Flimmerband normaler 3-Tage-Embryonen zu finden sind (Abb. 4C). Bezeichnenderweise war die Expression von hbn auf ein Niveau reduziert, das durch In-situ-Hybridisierung nicht nachweisbar war (Abb. 4F gegenüber Abb. 4E). QPCR-Messungen bestätigten diese Beobachtung und zeigten, dass die Spiegel der mRNAs von hbn undfoxq2, die die äußeren Grenzen bzw. die inneren Abschnitte der APD markieren, in Six3-Morphanten im Stadium der Mesenchym-Blastula um das 8- bis 10-fache reduziert waren (Abb. 5).

Six3 ist für die Expression der meisten Gene im E-APD-Set erforderlich

Der auffällige Phänotyp, der durch den Verlust von Six3 hervorgerufen wird, sowie seine frühe Expression im Embryo lassen vermuten, dass es in der Nähe der Spitze desAPD-Genregulationsnetzwerks funktionieren könnte. Um diese Möglichkeit weiter zu untersuchen, suchten wir mit Hilfe von Microarray-Analysen nach Six3-abhängigen Genen bei 27 Stunden, dem Zeitpunkt, an dem die Gene in der E-APD-Gruppe ihre maximale Expression erreichen. Um die endomesodermalen Funktionen von Six3 auszuschließen, führten wir diesen Screen in mit Cadherin injizierten Embryonen durch. Wie in Abb. 5A zu sehen ist, führte der Verlust von Six3 in diesen Embryonen zu einer vollständigen Eliminierung der Entwicklung aller überschüssigen Neuronen, die in Δcadherin-injizierten Embryonen gefunden wurden, und es bildete sich kein verdicktes Epithel, was wiederum eine wichtige Rolle für Six3 bei der APD-Entwicklung belegt. Die Mikroarraydaten ergaben eine überraschend große Anzahl von Genvorhersagen (682), die bei Embryonen, denen doppelt mRNA von Cadherin und Six3-MO injiziert wurde, im Vergleich zu Embryonen, denen nur mRNA von Cadherin injiziert wurde, stark herunterreguliert waren (mindestens 4-fach). Darüber hinaus wurden mehr als 60 % aller Gene aus dem vorherigen Microarray-Screening, die in mit Cadherin-mRNA injizierten Embryonen mindestens dreifach hochreguliert waren und daher wahrscheinlich in der APD exprimiert werden, durch den Verlust von Six3 signifikant herunterreguliert. Wichtig ist, dass die Microarray-Daten darauf hinweisen, dass die Mehrheit der E-APD-Gene empfindlich auf Six3 reagieren (Abb. 5B, gelb). In Übereinstimmung damit zeigten QPCR-Messungen in zwei anderen Embryonenchargen, dass nur 5 E-APD-Gene nicht signifikant von Six3 abhängen (Abb. 5B, rot, blau).

Die Überexpression von Six3 reicht aus, um die APD zu erweitern

Diese Ergebnisse untermauern die Idee, dass Six3 früh in den regulatorischen Netzwerken der APD-Gene funktioniert, und lassen die Möglichkeit aufkommen, dass es ausreicht, um andere Zellen im Embryo zu veranlassen, APD-Schicksale anzunehmen.Die Misexpression von Six3 führte zu Embryonen, die eine außergewöhnliche Veränderung der Morphologie aufwiesen. Ein hufeisenförmiges Band aus dicht gepackten Zellen erstreckte sich vom Tierpol aus in vegetaler Richtung (Abb. 6, vergleiche B,C mit A).Serotonerge Neuronen, die normalerweise auf die Tierplatte beschränkt sind (Abb. 6D), vermehrten sich um das Vierfache und waren entlang des dichten Bandes verteilt (Abb. 6G). Darüber hinaus sind die säulenförmigen Formen und die Anordnung der neuralen Projektionen in den Synaptotagmin-haltigen Zellen (1e11) denen in der Tierplatte der Kontrolletryonen ähnlich (Abb. 6E, weißer gestrichelter Kasten gegenüber Abb. 6H). Alle diese Zellen enthalten in ihren Kernen NK2.1 (Abb. 6J-M, grün), einen Transkriptionsfaktor, der normalerweise in der Tierplatte und dem angrenzenden upra-oralen Ektoderm (Abb. 6I, I′; grüne Kreise in Abb. 6U) sowie in einigen Zellen im Vorderdarm exprimiert wird (Takacs et al., 2004). Eine Kette von 1e11-positiven neuralen Zellen halbiert das Band (Abb. 6K, rot), und Zellen auf der unteren Seite des NK2.1-positiven Bandes exprimieren ebenfalls Gsc (Abb. 6L,N, rot). Die Kombination von NK2.1 und Gsc markiert eindeutig das supra-orale Gesichtsepithel an der oralen Kante der Tierplatte (Abb. 6I,I′, gelbe Zellen und Abb. 6U, gelbe Kreise). Die dicht gepackten säulenförmigen Zellen des erweiterten Bandes umgeben flachere Epithelzellen, die NK2.1, aber nicht Gsc exprimieren (Abb. 6M,N), wie auch die Zellen der oberen Regionen des Mundes normaler Embryonen (Abb. 6I, Mund, m). Ein weiterer Beweis dafür, dass diese Zellen denen in der Nähe des Mundes normaler Embryonen ähneln, ist, dass sie hbn mRNA exprimieren, die sich bei normalen 3-Tage-Embryonen um den Rand der Tierplatte ansammelt und sich in das supra-orale Ektoderm ausdehnt (Abb.1, Abb. 6O). In Six3-misexprimierenden Embryonen sind die hbn-positiven Zellen im dünnen Epithel am vegetalen Pol konzentriert und befinden sich damit in der gleichen Position in Bezug auf die erweiterte Tierplatte und die Nk2.1-positiven Zellen im oberen Vorderdarm wie in normalen Embryonen (Abb. 6P, Q). Die der oralen Region gegenüberliegende Seite differenziert sich als dünnschaliges Epithel, exprimiert den aboralen Ektodermmarker Spec1 (Abb. 6R-T) und entspricht möglicherweise dem hbn-positiven Streifen des aboralen Ektoderms neben der Tierplatte. Zusammengenommen führen diese Genexpressionsmuster zu der bemerkenswerten Schlussfolgerung, dass Six3 ausreicht, um das Schicksal der Zellen im größten Teil des restlichen Embryos neu zu spezifizieren und einen 3-Tage-Embryo zu erzeugen, der aus einem stark erweiterten, aber korrekt gemusterten Tierpolbereich mit oraler/aboraler Polarität besteht. Die APD in normalen und Six3-misexprimierenden Embryonen ist durch die blauen Kreise in Abb. 6U markiert.

Da misexprimiertes Six3 die gesamte APD ausdehnen und die Entwicklung ektopischer Neuronen fördern kann, fragten wir mit Hilfe von Microarray- und QPCR-Messungen, welche Gene im E-APD-Gensatz hochreguliert wurden.Tabelle 2 listet 10 solcher Gene auf, deren mRNA-Spiegel in Six3-mRNA-injizierten Embryonen mindestens um das Dreifache erhöht sind.

Six3 kann die TGF-β-Signalisierung unterdrücken, beseitigt aber nicht die orale/aborale Polarität

Six3-Misexpression beseitigt nicht die orale/aborale Polarität, weil orale undaborale Ektoderm-Marker auf entgegengesetzten Seiten des Embryos exprimiert werden und Neuronen, die normalerweise in der APD zu finden sind, auf ein dazwischen liegendes Band beschränkt sind.Allerdings reduziert misexprimiertes Six3 die Expression von Nodal sowie von Lefty und Chordin in Mesenchym-Blastulae (Tabelle 3, links), vielleicht weil Six3 positiven Input für die Expression von FoxQ2 liefert, von dem gezeigt wurde, dass es die Expression von Nodal unterdrückt (Yaguchi et al., Überraschenderweise unterdrückt Six3 die Akkumulation von bmp2/4 mRNA nicht in dem Maße, wie es die nodale Expression reduziert, obwohl die bmp2/4-Expression in normalen Embryonen eine nodale Funktion erfordert (Duboc et al., 2004). Dieses scheinbare Paradoxon könnte aus einer Kombination von verringerter Chordin-vermittelter Hemmung der BMP2/4-Signalübertragung in Verbindung mit der Diffusion von BMP2/4 und anschließender Autoaktivierung resultieren, wie in anderen Systemen nachgewiesen wurde (Biehs et al., 1996;Jones et al., 1992).

Kanonische Wnt-, nicht TGF-β-Signale verhindern die Ausdehnung der APD in das laterale Ektoderm

Die Signale, die die APD begrenzen, hängen von der kanonischen Wnt-Signalgebung ab, da ihre Eliminierung es der APD ermöglicht, fast den gesamten Embryo zu umfassen(Yaguchi et al., 2006)(Abb. 1). Da Nodal und BMP von kanonischen Wnt-Signalen abhängen, haben wir beide TGF-β-Liganden mit einem Nodal-MO (Yaguchi et al., 2008) eliminiert, um zu testen, ob sie für die Wnt-abhängige Einschränkung der APD verantwortlich sind. Abb.7B,F zeigt, dass dies nicht der Fall ist, da die serotonergen Neuronen in diesen Embryonen auf die APD beschränkt bleiben. Wenn jedoch Nodal-Morphanten mit exogenem Six3 versorgt werden, nimmt die Zahl der serotonergen Neuronen stark zu und sie erscheinen in der gesamten tierischen Hälfte des Embryos (Abb. 7D), wie dies auch bei Embryonen beobachtet wird, die Cadherin ektopisch exprimieren (Yaguchi et al., 2006) und bei denen die kanonische Wnt-Signalgebung ausfällt. Daher kann die ektopische Expression von Six3 die anderen Signale, vermutlich Wnt, außer Kraft setzen, die diese Neuronen auf dieAPD normaler Embryonen beschränken.

Obwohl sich serotonerge Neuronen im lateralen Ektoderm von Nodalmorphanten nicht bilden, tun dies einige nicht-serotonerge Neuronen (Abb. 7B). Dies ist in erster Linie, wenn auch nicht ausschließlich, auf den Verlust der BMP2/4-Signalübertragung zurückzuführen, da das gleiche Ergebnis in BMP2/4-MO-injizierten Embryonen erzielt wird (S.Y., J.Y., L.M.A., R.C.A. und R. D. Burke, unveröffentlicht). Da die Entwicklung aller Neuronen im normalen Embryo von Six3 abhängt, fragten wir, ob die ektopischen Neuronen in Nodalmorphanten auch von Six3 abhängen, indem wir Nodal-MO und Six3-MO gemeinsam injizierten. Erwartungsgemäß gingen die serotonergen Neuronen, die in Nodalmorphanten am Tierpol vorhanden waren, in den Doppelmorphanten verloren (Abb. 7G,H). Diese Embryonen enthalten keine differenzierten nicht-serotonergen Neuronen mit axonalen Fortsätzen, obwohl einige 1e11-immunreaktive Flecken beobachtet wurden. Diese könnten auf das Vorhandensein unvollständig differenzierter Neuronen hindeuten oder eine anfängliche neurale Ausrichtung der Ektodermzellen widerspiegeln, die normalerweise durch TGF-β-Signale außer Kraft gesetzt wird.

Six3 kann die Wnt-Signalisierung unterdrücken

Die Tatsache, dass sich die APD in Nodal-Morphanten nicht ausdehnt, wohl aber in Embryonen, denen Cadherin injiziert wurde, und dass Six3 kanonische, Wnt-abhängige Effekte im lateralen Ektoderm überwinden kann, lässt vermuten, dass Six3 die Wnt-Signalisierung unterdrückt. Zur Untermauerung dieser Hypothese stellen wir fest, dass die Six3-Misexpression die meisten Gene, die für Wnt-Liganden kodieren und während der frühen Entwicklung exprimiert werden, herunterreguliert (Tab. 3, links) (Abb. 8), darunter auch Wnt8, ein entscheidendes vegetatives Signal, das für eine normale Entwicklung des Endomesoderms erforderlich ist (Wikramanayake et al., 2004), ein Ergebnis, das mit der fehlenden vegetativen Entwicklung in Six3-misexprimierenden Embryonen übereinstimmt. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Grenzen des APD durch den Six3/Wnt-Antagonismus bestimmt werden.

Six3 reicht nicht aus, um die Expression von Wnt und Nodal im APD zu unterdrücken

Die Fähigkeit von Six3, die Gene, die Wnt-Liganden sowie Nodal, Lefty und Chordin kodieren, (direkt oder indirekt) stark herunterzuregulieren, lässt die Möglichkeit aufkommen, dass es normalerweise die Expression dieser Gene im APD verhindert. Um dies zu beurteilen, untersuchten wir zunächst die Auswirkungen von Six3 auf die Genexpression in Δcadherin-injizierten Embryonen, um mögliche gegenläufige Effekte der Six3-Funktion im Endomesoderm auszuschließen. Sowohl die Microarray- als auch die QPCR-Daten zeigen, dass Six3 in Embryonen, die größtenteils aus der APD bestehen, die Expression der Wnt-Gene sowie von nodal, lefty und chordin unterdrückt (Tabelle 3; Abb. 8). In normalen Embryonen (mit Glycerininjektion) kann die Six3-Unterdrückung dieser Gene jedoch nicht nachgewiesen werden (Tabelle 3; Abb. 8), was darauf hindeutet, dass zusätzliche Mechanismen die APD vor der Wnt- und TGF-β-Expression im normalen Embryo schützen.

Six3-Regulierung anderer Signalwege

Six3 reguliert auch (entweder direkt oder indirekt) Gene, die Proteine kodieren, die in anderen Signalwegen wirken (Tabelle 3). Dazu gehören Delta, der Notch-Ligand, der die laterale Hemmung, einen entscheidenden Prozess in der neuralen Entwicklung, vermittelt, sowie andere potenzielle Regulatoren der Neurogenese. Zu letzteren gehören fgf9/16/20, ein fgfr-ähnlicher, membrangebundener Rezeptor, dem die Tyrosinkinase-Domäne fehlt, und frizzled5/8, ein Wnt-Rezeptor, der möglicherweise nicht-kanonische Signale weiterleitet, dessen Funktion in der APD jedoch unbekannt ist (Croce et al., 2006). Zukünftige Studien werden untersuchen, wie die Aktivitäten dieser Signalwege und der frühen Six3-abhängigen Transkriptionsfaktoren im APD-Genregulationsnetzwerk interagieren.