Eine hochpolymorphe Insertion im Y-Chromosom-Amelogenin-Gen kann für Evolutionsbiologie genutzt werden, Populationsgenetik und Geschlechtsbestimmung bei Cetacea und Artiodactyla

Amelogenin kann für die molekulare Geschlechtsbestimmung und Evolutionsgenetik bei Cetartiodactyla verwendet werden

Die Amplifikation des untersuchten Abschnitts des Amelogenin-Locus unter Verwendung der artspezifischen SC1-SC2-Primer ergab einen offensichtlichen geschlechtsbezogenen Größenpolymorphismus bei allen Cetacea (Abb. 1). 1) mit einer einzigartigen 521 bp-Bande für Weibchen (zwei Amel-X-Kopien) und einer zusätzlichen 980 bp-Bande für das Amel-Y bei Männchen. Dieses Muster war bei männlichen Bartenwalen (Mysticetes) offensichtlich, aber es gab keine entsprechende Amel-X-Amplifikation bei männlichen Delfinen, es sei denn, man verwendete die Primer X5-X6, die von der menschlichen Amelogenin-Sequenz abgeleitet sind. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Amelogenin-Amplifikation zu allelischem Drop-out oder zumindest zu bevorzugter Amplifikation neigt. Diese Phänomene lassen sich durch mehrere Faktoren erklären. In der Regel wird die Amplifikation des kleineren Allels begünstigt, wenn die Menge der Polymerase ein limitierender Faktor ist oder wenn die Template-DNA abgebaut wird. Kleine DNA-Mengen können auch die Stochastizität des Annealings erhöhen. Unsere Ergebnisse stimmen jedoch nicht mit diesen Situationen überein, da das bevorzugte Allel (Amel-Y) immer das größte ist. Andererseits könnten Unterschiede im GC-Gehalt und Mismatches in den Annealing-Sequenzen für die unterschiedliche Amplifikation verantwortlich sein. Die von uns untersuchten Amelogenin-Fragmente sind durch einen höheren GC-Gehalt gekennzeichnet, wenn sie vom X-Chromosom (56 %) als vom Y-Chromosom (47 %) amplifiziert werden. Dieser Unterschied könnte auf eine Nicht-Insertion im Amel-X-Fragment zurückzuführen sein. Dieses Merkmal sowie eine 2 bp lange Fehlpaarung zwischen dem Amel-X-Fragment des Delfins und dem 5′-Ende des Reverse-Primers SC2 (Abb. 2) könnten eine bevorzugte Amplifikation der Y-Kopie bei Delfinen begünstigen (Abb. 1b). Die Amplifikation von männlichen Delfinproben mit SC3 (Primer ohne Fehlpaarung, siehe Abb. 2) anstelle von SC2 führt tatsächlich zu den beiden Banden, die bei Bartenwalen zu sehen sind. Das Vorhandensein dieser großen Insertion in der Amel-Y-Kopie kann zur Geschlechtsbestimmung bei wahrscheinlich allen Walarten verwendet werden.

Um die Bruchpunkte der Y-Insertionsstelle zu definieren und ihre Evolutionsgeschichte zu untersuchen, haben wir verschiedene Wale sequenziert (aufgelistet in Methoden; Sequenzen hinterlegt unter den folgenden Akzessionen: EMBL:AM744958 bis AM744971). Nach dem Alignment mit verfügbaren Sequenzen von Artiodactyla (siehe Liste in Methoden) konnten wir denselben Polymorphismus bei allen anderen Cetartiodactyla außer dem Schwein nachweisen (Abb. 3): eine 460-465 bp-Insertion (die Größe hängt von Indels innerhalb verschiedener Individuen oder Arten ab), die sich zwischen dem 4. und 5. Exon befindet (188. bis 651. Position der Y-Sequenzen, z. B. EMBL:AM744958). Die Namen der Haplotypen und die entsprechenden Akzessionen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Sequenzähnlichkeit wurde überprüft, indem BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) über die Sequenzen der GenBank nr/nt-Nukleotidsammlung mit dem Megablast-Algorithmus (für Sequenzen mit hoher Ähnlichkeit) ausgeführt wurde. Neben dem Rinder- und Schaf-Amel-Y stimmten die beiden einzigen relevanten Treffer (78 und 83 % Homologie, E-Werte 4,10-68 und 3,10-53) mit einem Fragment auf dem siebten Chromosom des Schweins (ca. 250 bp) überein, was darauf hindeutet, dass es sich bei der Insertion um ein transponierbares Element handeln könnte.

Wir interpretieren das Vorhandensein dieser Insertion als Synapomorphie (gemeinsames Merkmal) der Cetartiodactyla mit Ausnahme von Schweinen und wahrscheinlich anderen frühen abgeleiteten Gruppen (Kamele, Flusspferde; siehe Abb. 3). Zusätzlich zu dieser langen Insertion wurden 46 weitere Indels durch Sequenzalignment entdeckt (Positionen und Größen sind in Abbildung 5 dargestellt). Indels sind besonders nützlich, um phylogenetische Hypothesen zu testen, da sie eher Informationen über alte Divergenzen als über Populationen liefern können. Wir haben daher untersucht, ob sich die phylogenetischen Topologien unterscheiden, wenn wir die in diesen Indels enthaltenen Informationen berücksichtigen oder nicht. So wurden die in Tabelle 1 zusammengefassten Sequenzen der Wale sowie die Sequenzen der Artiodactyla zunächst klassisch analysiert, wobei Lücken als fehlende Zeichen kodiert wurden, und anschließend mit Lücken, die als zusätzliche binäre Zeichen kodiert wurden (siehe Abb. 5). Für jede Analyse wurden zwei unabhängige Bayes’sche Suchen durchgeführt. Die in Abbildung 4 dargestellten phylogenetischen Bäume resultieren aus einem Konsens von 20.000 Bäumen, die ausgewählt wurden, nachdem die Standardabweichung zwischen den beiden Durchläufen unter 0,01 gefallen war. Sie zeigen stark unterstützte Knoten. Die phylogenetische Analyse des kompletten Segments (Abb. 4a) bestätigte die Clusterbildung nach Geschlechts-Chromosomenkopie bei Cetartiodactyla (Stenella cœruleoalba, Balænoptera physalus, Grampus griseus, Tursiops truncatus, Bos taurus und Ovis aries), während Amel-X und Amel-Y bei anderen Säugetieren (Homo sapiens, Sus scrofa) zusammen mit Amel-X aus Cetartiodactyla geclustert wurden. Die Ableitung der Phylogenie ohne Berücksichtigung der Insertion ergab dagegen ein anderes Ergebnis (Abb. 4b): Während die Haplotypen bei den Walen auch nach Chromosomen geclustert wurden, war bei den anderen Cetartiodactyla kein Signal zu erkennen, das mit der Artgeschichte oder der Chromosomenlage zusammenhing. Das phylogenetische Signal, das sich auf die Artengeschichte bezieht, scheint sich also zu verstärken, wenn wir den Baum von den Cetartiodactyla in Richtung der Primaten verfolgen. Dieses partielle, homoplasmatische Fortbestehen des phylogenetischen Signals kann durch den Einfluss der Region um die Insertion erklärt werden. Dies könnte auf das hohe Alter der Insertion (74-87 myrs ) zurückzuführen sein. Der anschließende Verlust der Homologie könnte in einigen Taxa (Cetacea) zu einer divergenteren Entwicklung zwischen den Chromosomen geführt haben als in anderen (Artiodactyla).

Es wäre interessant, diese Region auf der gesamten Kladenebene zu untersuchen, indem Sequenz- und Indel-Zeichen in derselben Analyse kombiniert werden. Dies könnte Anhaltspunkte für die Überprüfung der zahlreichen Hypothesen über die basale Radiation der Cetartiodactyla liefern (z. B. ). In Anbetracht der vermutlich basalen Position der Suioidea und Tylopoda in der Cetartiodactyla-Phylogenie ( und Abb. 3), stellen wir die Hypothese auf, dass das wichtige evolutionäre Ereignis, das durch die Einfügung dargestellt wird (dargestellt durch einen Pfeil in Abbildung 4a), einmal in der Cetacea-Ruminantia-Klade und nicht in den übrigen Cetartiodactyla stattfand.

Das Vorhandensein dieser großen Insertion in der Amel-Y-Kopie kann für die Geschlechtsbestimmung nützlich sein.

Die Evolutionsgeschichte deutet auch darauf hin, dass unsere Technik zur Geschlechtsbestimmung nicht nur bei Walen, sondern auch bei einer Vielzahl von Cetartiodactyla-Arten, einschließlich Haus- und Wildtieren, anwendbar ist, insbesondere bei den weit verbreiteten Ruminantia (Bovidae, Capridae und höchstwahrscheinlich Cervidae). Sie eignet sich jedoch nicht für die Suiformes, und es sind weitere Studien erforderlich, um zu bestätigen, dass die Technik auch nicht auf die Camelidae anwendbar ist, da diese in der Phylogenie der Cetartiodactyla eine noch basalere Position einnehmen.

Verwendung bei der Bewertung von Stammbäumen und in der Populationsgenetik

Bei Delfinen konnten die mit dem SC1-SC2-Primerpaar amplifizierten Amel-Y-Fragmente leicht sequenziert werden, ohne dass eine Klonierung erforderlich war, da die Amplifikation Y-Chromosom-spezifisch war. Von den zehn sequenzierten Proben des Gestreiften Delfins waren neun männlich, und wir konnten sieben verschiedene Y-Haplotypen (ein Haplotyp, der von drei Individuen repräsentiert wird, und vier individuelle Haplotypen) mit 64 polymorphen Stellen (Nukleotiddiversität π = 0,004 ± 0,0007) ableiten. Die Hälfte dieser Stellen befand sich in der ~460 bp-Insertion. Ein Alignment der polymorphen Stellen ist in Abbildung 5 (a) dargestellt. Auffallend ist, dass diese Sequenzen zwei stark divergierende Haplogruppen zeigen, die sich um durchschnittlich 49 Substitutionen unterscheiden. Dies stimmt mit unseren Ergebnissen überein, die die wahrscheinliche Existenz von zwei Unterarten im Mittelmeer belegen (unveröffentlichte Daten). Darüber hinaus wies eine dieser Haplogruppen einen hohen Grad an Polymorphismus auf, mit 24 informativen Stellen, während die anderen nur acht aufwiesen. Diese Werte sind ausreichend für die Verwendung in der Stammbaumanalyse und Populationsgenetik, da das Y-Chromosom das Gegenstück zur mitochondrialen d-Schleife bei dieser Art ist. In der Tat ist beim Streifendelfin die intra-spezifische Divergenz (zwischen den Gruppen) größer als die inter-spezifische Divergenz mit einem Mittelwert von 45 Nukleotid-Substitutionen zwischen den Sequenzen des Streifendelfins und des Finnwals. Beim Vergleich der beiden Streifendelfinpopulationen ergeben sich durchschnittlich 0,048 ± 0,01 Substitutionen pro Stelle. Dies ist vergleichbar mit der beobachteten Divergenz zwischen den beiden Populationen und dem Gewöhnlichen Delfin (0,058 ± 0,03) und bestätigt, dass die Nukleotiddiversität um eine Größenordnung höher ist als die für Y-Chromosomen-Marker bei Säugetieren beobachtete Bandbreite (10-4). Wie bei der mitochondrialen d-Schleife schränkt die Größe des amplifizierten Fragments die Anwendung der Technik leicht ein. Einige degradierte Proben lassen sich nicht amplifizieren; dennoch war eine besonders degradierte Pottwalprobe immer noch amplifizierbar (Daten nicht gezeigt).

Da die Y-Chromosomenpopulation eine geringe effektive Größe haben dürfte, ist es wahrscheinlicher, dass sie durch genetische Drift beeinflusst wird. Sie spiegelt also jüngere demographische Ereignisse wie Engpässe, Expansionen oder Gründereffekte wider. Um diese Art von Ereignissen zu untersuchen, benötigt man einen Marker, dessen Diversität hoch genug ist, um die Rekonstruktion von Stammbäumen mit den geringsten Mehrdeutigkeiten und in Regionen zu ermöglichen, in denen die Rekombination die Eindeutigkeit der Bäume nicht beeinträchtigt. Zu diesem Zweck stellen hochvariable Mikrosatelliten wertvolle Marker dar, aber sie erfordern intensive Berechnungsmethoden, um die Unsicherheiten in den Stammbäumen zu berücksichtigen, die sich aus Allelen ergeben, die durch den Zustand und nicht durch Abstammung identisch sind (Homoplasien). Die Hinzufügung eines neuen Sequenzmarkers ist daher für die Populationsgenetik des Y-Chromosoms bei Cetartiodactyla von Interesse. Darüber hinaus zeigt die Bayes’sche Schätzung der Mutationsrate an jeder Kante beider Bäume in Abb. 4, die gemeinsam mit der phylogenetischen Inferenz berechnet wurde, hohe Werte für einen Marker der Kern-DNA: zwischen 10-8 und 10-10 Substitutionen pro Stelle und pro Jahr in allen Cetartiodactyla-Zweigen. Dieser Wert liegt zwischen denen der mitochondrialen d-loop und der Kern-DNA bei Säugetieren.

Funktionelle Perspektiven in der Amelogenin-Evolution

Wir fanden zwei Stoppcodons an den Aminosäurepositionen 98 und 99 des Exons 5 in allen Y-Chromosom-Kopien von Amelogenin bei den vier untersuchten Walarten (Positionen 988-993 der Sequenz EMBL:AM744959). Das Produkt des Amel-Y-Gens könnte daher bei diesen Arten abgeschnitten sein oder ein Pseudogen darstellen, wie es bereits bei Arten aus den meisten anderen Eutherienkladen beobachtet wurde

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