Sanes und Lichtman benutzten die pronukleare Injektion, um diese Brainbow-Konstrukte in Mäuse einzuführen. Als sie die Gehirne der Mäuse abbildeten, fanden sie viel mehr als 3-4 Farben aufgrund der Tandem-Integration mehrerer Kopien des Konstrukts (etwa 8 in Brainbow-1.0-Mäusen). Der kombinatorische Effekt mehrerer, unabhängiger Rekombinationsereignisse führt zu einem Regenbogen von Farben. Bei drei Kopien des Konstrukts würde man zehn Farben erwarten (siehe Tabelle rechts); in verschiedenen Berichten haben Sanes und Lichtman aufgrund der höheren Kopienzahl zwischen 90 und 160 verschiedene Farben beobachtet. Der Name Brainbow ist wirklich passend für diese bunte Technologie.
Optimierung des Systems: Brainbow-3
Obwohl Brainbow den Neurowissenschaftlern die breite Palette von Farben zur Verfügung stellte, die zur Markierung einzelner Neuronen benötigt wurden, litt das System auch unter einer Reihe von Einschränkungen. Erstens war die Bildgebung von Brainbow-Mausgewebe aufgrund der geringen Fluoreszenzintensität schwierig, was zum Teil auf die Photoinstabilität der Fluorophore zurückzuführen ist, sowie auf die Tendenz der Fluorophore, sich in den Somata der Neuronen zu sammeln. Zweitens erlaubte das System keine Analyse durch Immunfärbung. Obwohl sich die verwendeten Fluorophore fluoreszierend unterscheiden, sind ihre Proteinsequenzen sehr homolog, was die Entwicklung spezifischer Antikörper für jedes Fluorophor verhindert. Drittens enthielten Brainbow-1 und Brainbow-2 jeweils einen „Standard“-Zustand; Brainbow-1.0 exprimiert beispielsweise RFP, wenn das Konstrukt keine Rekombination erfahren hat. Dieser Standardzustand wurde von der Mehrheit der Neuronen unverhältnismäßig stark exprimiert, was die Anzahl der verschiedenen Farben, die in einem bestimmten Bereich beobachtet werden konnten, einschränkte.
Im Jahr 2013 veröffentlichten Dawen Cai und andere eine Weiterentwicklung der Brainbow-Technologie, Brainbow-3.0, mit dem Ziel, die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Zunächst untersuchten sie eine Reihe von fluoreszierenden Proteinen, um diejenigen mit idealen Eigenschaften zu finden (geringe Aggregation, hohe Photostabilität und hohe Stabilität nach der Fixierung). Aus den sieben resultierenden Proteinen wählten sie drei mit geringen Fluoreszenz- und Sequenzüberschneidungen aus (mOrange2 aus Korallen, EGFP aus Quallen und mKate2 aus Seeanemonen). Anschließend stellten sie erfolgreich maßgeschneiderte Antikörper für jedes dieser Proteine her und bestätigten, dass es keine Kreuzreaktivität gab, was die Tür für Immunfärbeanalysen öffnete. Um eine gleichmäßige Zellmarkierung zu erreichen, erzeugten sie farnesylierte Derivate der fluoreszierenden Proteine, die direkt zu den Zellmembranen transportiert werden. Das Membran-Trafficking der farnesylierten Derivate ermöglicht die Markierung empfindlicher axonaler und dendritischer Prozesse, die zuvor mit Brainbow-1 und -2 nicht sichtbar waren.
Die allgemeine Struktur von Brainbow-1.0 wurde in Brainbow-3.0 beibehalten, jedoch mit mOrange2, EGFP und mKate2 als Fluorophore; mOrange2 ist der Standardzustand. Im Gegensatz dazu zeigen Brainbow-3.1 und -3.2 keine Standardfluoreszenz, da unmittelbar nach dem Promotor eine die Translation blockierende STOP-Kassette hinzugefügt wurde. Die STOP-Kassette enthält eine YFP-Mutante, die nicht fluoresziert, aber durch Immunfärbung nachgewiesen werden kann. Diese Eigenschaft erleichtert das Screening von Cre-negativen Brainbow-Mäusen, um die Anzahl und Art der Zellen zu bestimmen, in denen das Konstrukt exprimiert wird. Die Photostabilität von Brainbow-3.2 wurde durch die Hinzufügung eines posttranskriptionalen regulatorischen Elements (WPRE) des Woodchuck-Hepatitis-Virus verbessert, das üblicherweise zur Erhöhung des Transgenproteinspiegels verwendet wird.
Brainbow-Varianten und Anwendungen jenseits des Mausgehirns
Neben der Verbesserung des Brainbow-Systems entwickelten Sanes und Lichtman auch ein komplementäres Flpbow-Konstrukt, das funktionell dem Cre-basierten Brainbow ähnelt, aber durch FLP/FRT-Rekombinase kontrolliert wird. Wenn Brainbow und Flpbow unter verschiedenen Promotoren platziert werden, können sie zur Markierung verschiedener Zellpopulationen verwendet werden.
Um den Züchtungsaufwand zu verringern, der zur Erzeugung von Tieren mit Brainbow-Transgenen und Cre erforderlich ist, haben Cai et al. auch ein Autobow-Konstrukt entwickelt, das sowohl Cre als auch XFPs enthält. Die Cre-Produktion steuert die Rekombination und die XFP-Selektion, gefolgt von der Cre-Selbstselektion. Diese Konstrukte werden über mindestens sechs Generationen stabil gehalten.
Neben den neuronalen pThy1-Brainbow-Konstrukten bietet Addgene auch zwei Brainbow-Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAV) an – AAV-EF1a-BbChT und AAV-EF1a-BbTagBY. Diese Konstrukte enthalten aufgrund der Größenbeschränkungen von AAV jeweils zwei XFPs; eine Koinfektion mit beiden Konstrukten ergibt mindestens 8 Farben. Die Verwendung von AAV ermöglicht eine räumliche und zeitliche Kontrolle, ohne dass eine Keimbahnmodifikation erforderlich ist, und ermöglicht die Verwendung von Brainbow bei einer Vielzahl von Arten.
Weitere Varianten wurden von anderen Labors entwickelt, darunter R26R-Confetti, beschrieben in Hugo J. Snippert, et al. (2010), und die MAGIC-Marker-Strategie, beschrieben in Karine Loulier, et al. (2014).
Gegenwärtig werden Brainbow-Techniken auch zur Untersuchung von Modellorganismen wie Drosophila und Zebrafisch eingesetzt. Bei Drosophila hat Brainbow bei der Kartierung neuronaler Schaltkreise geholfen, z. B. bei Verbindungen zwischen motorischen Neuronen und der neuromuskulären Verbindung. Bei Zebrafischen hat sich die Methode als sehr nützlich für die Verfolgung der Abstammung erwiesen; „Zebrabow“ wurde verwendet, um die Entwicklung des Hornhautepithels zu verfolgen.
Für Wissenschaftler, die sich für Neurowissenschaften und Entwicklung interessieren, ist Brainbow ein wertvolles Instrument, um einzelne Zellen zu markieren und zu verfolgen, da es eine breite Palette und eine hohe Stabilität von Farben bietet. Sanes und Lichtman schätzen, dass die farbige Markierung von Brainbow die Kartierungszeit für einen bestimmten Gehirnabschnitt um mindestens eine Größenordnung verkürzt hat. Es ist klar, dass weitere Verfeinerungen der Brainbow-Technik wichtige Einblicke in die komplizierte physikalische Organisation des Gehirns und anderer biologischer Systeme liefern werden.
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Transgene Strategien für die kombinatorische Expression von fluoreszierenden Proteinen im Nervensystem. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
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Intestinale Kryptenhomöostase ist das Ergebnis einer neutralen Konkurrenz zwischen sich symmetrisch teilenden Lgr5-Stammzellen. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
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