Funktionen von Danggui Buxue Tang, einer chinesischen Kräuterabkochung, die Astragali Radix und Angelicae Sinensis Radix enthält, in Uterus und Leber sind sowohl Östrogenrezeptor-abhängig als auch -unabhängig

Abstract

Danggui Buxue Tang (DBT), eine Kräuterabkochung, die Astragali Radix (AR) und Angelicae Sinensis Radix (ASR) enthält, wird in China seit mehr als 800 Jahren zur Behandlung von Unregelmäßigkeiten in den Wechseljahren bei Frauen eingesetzt. Pharmakologische Ergebnisse zeigten, dass DBT in vitro signifikante östrogene Eigenschaften aufwies, was darauf hindeutet, dass DBT die nuklearen Östrogenrezeptoren aktivieren könnte. Hier haben wir die östrogenen Eigenschaften von DBT in einem ovarektomierten In-vivo-Rattenmodell untersucht: DBT wurde den ovarektomierten Ratten für 3 Tage verabreicht. Die Anwendung von DBT veränderte nicht das Gewicht von Gebärmutter und Leber sowie die Transkriptausdrücke der Proliferationsmarker einschließlich der Östrogenrezeptoren α und β. DBT stimulierte jedoch die Transkriptausdrücke der östrogenempfindlichen Gene. Darüber hinaus wurde die induktive Rolle von DBT auf die Expression von Mitgliedern der Arylkohlenwasserstoffrezeptorfamilie im Uterus und in der Leber von ovarektomierten Ratten bestätigt. Diese Reaktionen von DBT unterschieden sich jedoch deutlich von dem Reaktionsmuster, das hier für 17β-Östradiol nachgewiesen wurde. DBT wies also schwache, aber signifikante östrogene Eigenschaften in vivo auf; einige seiner Aktivitäten waren jedoch unabhängig vom Östrogenrezeptor. Somit könnte DBT eine interessante chinesische Kräuterabkochung für eine alternative Behandlung der Hormonersatztherapie für Frauen in den Wechseljahren ohne nachfolgende östrogene Nebenwirkungen sein.

1. Einleitung

Traditionelle chinesische Arzneimittel (TCM) werden in China seit über tausend Jahren als Arzneimittel oder Nahrungsergänzungsmittel verwendet. Historisch gesehen werden TCMs als Abkochungen nach einer einzigartigen Methode mit spezifischen Kombinationen verschiedener Kräuter als Formel zubereitet. Unter Tausenden von Kräuterrezepturen ist Danggui Buxue Tang (DBT) eine einfache Kräuterabkochung, die aus zwei Kräutern besteht. DBT wurde erstmals im Neiwaishang Bianhuo Lun von Li Dongyuan in China im Jahr 1247 n. Chr. beschrieben. Li beschrieb, dass die DBT-Formel 10 qian Astragali Radix (AR), Wurzeln von Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge oder Astragalus membranaceus (Fisch.) Bungevar. mongholicus (Bunge) P.K. Hsiao, und zwei qian Angelicae Sinensis Radix (ASR), Wurzeln von Angelica sinensis (Oliv.) Diels enthalten sollte. Ein Qian entspricht etwa 3 Gramm. DBT wird Frauen in China als Mittel gegen Wechseljahrsbeschwerden verschrieben, das ihre Gesundheit verbessert, indem es das „Qi“ (Lebensenergie) anhebt und das „Blut“ (Körperkreislauf) nährt.

Frauen in den Wechseljahren leiden unter Hitzewallungen, Schweißausbrüchen, Angstzuständen und Stimmungsschwankungen sowie unter einem erhöhten Risiko für viele Gesundheitsprobleme, wie z.B. dem Verlust der Knochendichte (Osteoporose) und Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Diese Probleme sind weitgehend auf den Mangel an Eierstockhormonen, insbesondere an Östrogenen, zurückzuführen. Die Hormonersatztherapie (HRT) wurde viele Jahre lang zur Linderung von Wechseljahrsbeschwerden eingesetzt, aber diese Behandlung war mit Nebenwirkungen verbunden, d. h. mit einem erhöhten Risiko für Brustkrebs, Herzinfarkt und Schlaganfall. Angesichts dieser klinischen Risiken wurden große Anstrengungen unternommen, um neue Medikamente zu suchen oder zu entwickeln, die die Vorteile einer Hormontherapie bieten, aber nur minimale Risiken aufweisen. Die TCM, die Tausende von Heilkräutern enthält, ist eine vielversprechende Ressource, die eine perfekte Lösung bieten könnte. In der Tat zeigten einige der pflanzlichen Produkte eine ausgeprägte Wirksamkeit bei Wechseljahrsbeschwerden und wurden daher von vielen Frauen zur Linderung ihrer Wechseljahrsbeschwerden verwendet, z. B. DBT . In-vitro-Experimente mit Brustdrüsen- und Knochenzellen deuten darauf hin, dass zumindest ein Teil der Wirksamkeit von DBT durch Östrogenrezeptor- (ER-) abhängige Mechanismen vermittelt wird. Um diese Beobachtungen in vivo zu untermauern, wurde DBT im Modell der ovarektomierten Wistar-Ratte auf mögliche östrogene Eigenschaften getestet. Da DBT eine Abkochung ist, die traditionell als Tee getrunken wird, wurde den Tieren DBT über das Trinkwasser zugeführt. Mit diesem Ansatz haben wir einen dreitägigen uterotrophen Test durchgeführt, um Reaktionen aufzuzeigen, die zur Aufklärung der molekularen Wirkmechanismen von DBT beitragen, einschließlich der Organgewichte und der Regulierung der Genexpression.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial und DBT-Zubereitung

Dreijährige AR aus den Wurzeln von A. membranaceus var. mongholicus wurde in der Provinz Shanxi gesammelt, und zweijährige ASR von A. sinensis stammte aus Minxian in der Provinz Gansu. Diese Pflanzenmaterialien wurden von Dr. Tina Dong während der Feldsammlung morphologisch authentifiziert. Die entsprechenden Belege in Form ganzer Pflanzen, Beleg Nr. 02-9-1 für ASR und Beleg Nr. 02-10-4 für AR, wurden im Zentrum für Chinesische Medizin, The Hong Kong University of Science and Technology, hinterlegt. 17β-Estradiol (E2) wurde von Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. 250 g in Scheiben geschnittene AR und 50 g in Scheiben geschnittene ASR wurden gemischt (das Verhältnis ist 5 : 1) und dann in 2.400 mL (w : v = 1 : 8) Wasser 2 Stunden lang gekocht, und dann wurde der Sud gefiltert. Die Rückstände wurden 1 Stunde lang in 1.800 mL (w : v = 1 : 6) Wasser gekocht. Die kombinierten Extrakte wurden unter Vakuum getrocknet und bei -20°C gelagert. Diese Extraktion nach der alten Zubereitung erwies sich als die beste Extraktionsbedingung. Zwei chemische Marker in AR (Calycosin und Formononetin) und zwei weitere in ASR (Ferulasäure und Ligustilid) wurden zur Standardisierung der chemischen Eigenschaften von DBT verwendet. Die standardisierte DBT sollte nicht weniger als 0,186 mg Calycosin, 0,155 mg Formononetin, 0,351 mg Ferulasäure und 0,204 mg Ligustilid pro 1 g Trockengewicht der DBT enthalten, wie zuvor berichtet.

2.2. Tiere

Jugendliche weibliche Wistar-Ratten ( g) wurden von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland) bezogen und unter kontrollierten Temperatur- (20°C ± 1, relative Luftfeuchtigkeit 50-80%) und Beleuchtungsbedingungen (12 Stunden Licht, 12 Stunden Dunkelheit) gehalten. Alle Ratten hatten freien Zugang zu Standard-Rattenfutter (SSniff R10-Diet, SSniff GmbH, Soest, Deutschland) und Wasser. Alle Tierhaltungs- und Handhabungsbedingungen entsprachen den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee in Deutschland.

2.3. Uterotropher Assay

Die Östrogenität wurde im 3-Tage-Assay an ovarektomierten Ratten gemäß der OECD-Richtlinie 440 getestet. Die Versuchsverfahren sind in Abbildung 1 schematisch zusammengefasst. Kurz gesagt, nach der Ovarektomie und einem 14-tägigen Rückgang der endogenen Hormone wurden die Tiere 3 Tage lang behandelt. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip der Behandlung mit Kräuterextrakten, der Positivkontrolle oder der Vehikelgruppe zugewiesen (). DBT wurde oral in einer Dosierung von 0,01 g/kg KG/d oder 1 g/kg KG/d BW und E2 (1 μg/kg KG/d; subkutane Injektion), das als Positivkontrolle diente, verabreicht. Die Tiere wurden nach leichter Narkose mit CO2-Inhalation durch Enthauptung geopfert. Die Feuchtgewichte von Uterus und Lebern wurden bestimmt. Uteri und Lebern wurden für die RNA-Präparation in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Abbildung 1

Versuchsaufbau. Die Abbildung fasst den Versuchsplan der Studie zusammen. Sie zeigt schematisch den Arbeitsablauf, sowie die Zusammenfassung der einbezogenen Behandlungsgruppen. bw: Körpergewicht; DBT: Danggui Buxue Tang; DBT01 und DBT1: DBT bei 0,01 und 1 g/kg Körpergewicht/d.

2.4. Vorbereitung der Gesamt-RNA und Reverse Transkription

Die gesamte zytoplasmatische RNA wurde aus den Uteri der Ratte mit der Standardmethode TRIzol (Invitrogen, Grand Island, NY) extrahiert. DNA-Reste wurden enzymatisch durch Verdauung entfernt (Deoxyribonuclease I, Ambion, Foster City, CA), und die Entfernung wurde durch PCR überprüft. Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen) und Oligo (dT) 12-18 wurden für die cDNA-Erststrangsynthese verwendet.

2.5. Quantitative Echtzeit-PCR

Die quantitative Echtzeit-PCR wurde mit Platinum Taq DNA-Polymerase (Invitrogen) unter Verwendung des iCycler-Thermocyclers mit iQ-Echtzeit-Detektionssystem durchgeführt. Die Reaktionen wurden dreimal in dreifacher Ausführung durchgeführt. Nach dem Vortexen wurden 50 μl der Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-Dünnwand-PCR-Platte (Bio-Rad, Hercules, CA) pipettiert. Die PCR-Reaktionen bestanden aus einem ersten Denaturierungszyklus bei 95°C für 3 Minuten, gefolgt von 50 Zyklen von 10 s bei 95°C, 15 s bei 60°C und 30 s bei 72°C. Die Fluoreszenz wurde am Ende des 60°C-Annealing-Schrittes quantifiziert und die Produktidentität wurde durch eine Schmelzkurvenanalyse (60-95°C) bestätigt. Die Primersequenzen und Amplikongrößen sind in der ergänzenden Tabelle 1 im Ergänzungsmaterial zusammengefasst, das online unter http://dx.doi.org/10.1155/2014/438531 verfügbar ist. Die relativen mRNA-Mengen der Zielgene wurden nach Normalisierung auf ein endogenes Referenzgen (Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 1, COX1) berechnet. Die Ergebnisse wurden als relative mRNA-Mengen im Vergleich zu den Tieren der Vehikelkontrolle mit der Formel

2,6 ausgedrückt. Statistische Analyse

Die statistische Analyse der Daten in dieser Arbeit wurde mittels zweifacher Varianzanalyse durchgeführt, gefolgt von einem paarweisen Vergleich ausgewählter Mittelwerte unter Verwendung des Student’s -Tests. Das Kriterium für die Signifikanz wurde auf , , und im Vergleich zur Kontrolle festgelegt.

3. Ergebnisse

3.1. Körpergewicht und Organfeuchtgewichte

Die uterotrophe Reaktion bei ovarektomierten Ratten wurde nach 3 Tagen der medikamentösen Behandlung gemessen. DBT wurde in zwei Dosen von 0,01 (DBT0,01) und 1 (DBT1) g/kg KG/d verabreicht. Als Positivkontrolle wurde E2 in einer Dosierung von 1 μg/kg KG/d verwendet, und der Trägerstoff Rizinusöl diente als Negativkontrolle. Diese Behandlungen hatten keinen Einfluss auf das Körpergewicht der Tiere (Abbildung 2(a)). Was die Feuchtgewichte betrifft, so führte eine dreitägige Behandlung mit E2 zu einem signifikanten Anstieg des Feuchtgewichts der Gebärmutter um mehr als das Fünffache, hatte jedoch keinen Einfluss auf das Lebergewicht (Abbildung 2(b)). Die Behandlung mit DBT, sowohl in der Konzentration DBT0,01 als auch DBT1, hatte keinen Einfluss auf das Gewicht von Uterus und Leber (Abbildung 2(b)). Diese Beobachtung stand im Einklang mit der Expression der mRNA von Ki-67, einem empfindlichen Proliferationsmarker in der Gebärmutter, die jedoch nach der DBT-Behandlung unverändert war (Abbildung 2(c)). Die Expression von Ki-67 mRNA wird durch die Behandlung mit E2 stark stimuliert (Abbildung 2(c)). In der Leber führte keine der Behandlungen zu einem statistisch signifikanten Einfluss auf die Expression von Ki-67 (Abbildung 2(c)).

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Abbildung 2

Die Wirkung von E2 oder DBT auf das Körper- und Organgewicht der Tiere. (a) Die ovariektomierten Tiere wurden drei Tage lang mit E2 (1 μg/kg KG/d; subkutan) oder DBT (0,01 g/kg/d KG und 1 g/kg/d KG, oral) behandelt; unbehandelte ovariektomierte Tiere dienten als Kontrollgruppe (Ctrl.). Das Körpergewicht der Ratten vor der Tötung wurde bestimmt. Die feuchten Organe, einschließlich Uterus und Leber, wurden gewogen. (c) Die Regulierung der mRNA-Expression des Proliferationsmarkers Ki-67 in Gebärmutter und Leber wurde mittels semiquantitativer Echtzeit-PCR-Analyse analysiert. Asterisken zeigen Werte an, die sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen unterscheiden. , , und .

3.2. Östrogen-assoziierte Genexpression in Uterus und Leber

Die mRNA-Expression von ERα und ERβ wurde im Uterus der Ratte unter allen Behandlungsbedingungen nachgewiesen. Nach der Behandlung mit E2 zeigten die ERα- und ERβ-mRNAs die erwartete signifikante Downregulation im Vergleich zu den Kontrolltieren, während die DBT-Anwendung die mRNA-Expression von ERα und ERβ nicht beeinflussen konnte (Abbildung 3(a)). Für die ER-Wirkung in der Gebärmutter sind einige sehr empfindliche Markergene bekannt, die die östrogenen Reaktionen überwachen, nämlich Komplement C3 (C3), Calcium-bindendes Protein 9 kDa (CaBP9k) und Clusterin (Clu). Im Uterus führte die E2-Behandlung zu einer mehrhundertfachen signifikanten Hochregulierung der mRNA, die für C3 und CaBP9k kodiert, begleitet von einer signifikanten Herunterregulierung der Clu-mRNA-Expression (Abbildung 3(b)). Offensichtlich war DBT in der Lage, eine sehr milde Hochregulierung (nicht mehr als das 5-fache) der ER-abhängig regulierten Gene C3 und CaBP9k auszulösen. Die höhere DBT-Dosis bewirkte eine Herabregulierung der Clu-mRNA-Expression, die jedoch aufgrund der hohen Standardabweichung des Mittelwerts kein statistisch signifikantes Niveau erreichte (Abbildung 3(b)).

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Abbildung 3

Regulation der Expression von Östrogenrezeptoren und Östrogenantwortgenen in der Gebärmutter. (a) Die mRNA-Expression von ERα und ERβ in der Gebärmutter und (b) die mRNA-Expression von Östrogenreaktionsgenen, einschließlich C3, CaBP9k und Clu, wurden durch quantitative Echtzeit-PCR-Analyse analysiert. Asterisken zeigen Werte an, die sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen unterscheiden. , , und .

Die mRNA-Expression von ERα wurde in der Rattenleber unter allen Behandlungsbedingungen nachgewiesen. Die autoregulatorische Reaktion der Herabregulierung von ERα durch E2 erreichte nicht das Niveau der statistischen Signifikanz, wohingegen beide DBT-Konzentrationen die Steady-State-mRNA-Spiegel von ERα in statistisch signifikanter Weise herabregulierten (Abbildung 4(a)). Um die Expression von ERα-abhängigen Reaktionsgenen in der Leber zu bewerten, wurden die Expressionsniveaus geeigneter leberspezifischer ER-Reaktionsgene, d. h. CaBP9k und Insulin-like growth factor binding protein I (IGFBP1), bestimmt. Die E2-Behandlung führte zu einer Hochregulierung der CaBP9k-mRNA-Expression und zu einer Herunterregulierung der 1GFBP1-mRNA-Expression in der Leber (Abbildung 4(b)). Die Behandlung mit einer hohen Dosis DBT (DBT1) reduzierte die Expression von IGFBP1 signifikant. Die erhöhte Expression von CaB9k wurde nach der DBT-Behandlung in beiden Konzentrationen festgestellt, erreichte aber in beiden Fällen aufgrund der Schwankungen nicht das Niveau der statistischen Signifikanz (Abbildung 4(b)).

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Abbildung 4

Regulation der Expression von Östrogenrezeptoren und Östrogenantwortgenen in der Leber. Die mRNA-Expression von ERα in der Leber (a) und die mRNA-Expression der Östrogenreaktionsgene einschließlich CaBP9k und IGFBP1 in der Leber (b) wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR-Analyse analysiert. Asterisken zeigen Werte an, die sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen unterscheiden. , , und .

3.3. Lipidstoffwechsel-assoziierte Genexpression in der Leber

Da man annimmt, dass DBT das „Qi“ erhöht, haben wir die Expression von Genen untersucht, die mit dem Lipidstoffwechsel in Verbindung stehen. Da die Leber der wichtigste Ort des Fettstoffwechsels ist, steht ihre Funktion in Zusammenhang mit Fettleibigkeit, die wiederum ein Risikofaktor für Krankheiten in hormonabhängigen Organen wie Brustkrebs ist. Wir untersuchten daher die Expression von Apolipoprotein A-I (Apo-A1), dem Hauptbestandteil von HDL-Cholesterin, und von Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptoren (PPAR), die Lipidsensoren darstellen und in verschiedener Weise an der Regulierung des Energiestoffwechsels beteiligt sind. Die Hochregulierung von PPARα durch DBT erreichte nicht das Niveau der statistischen Signifikanz. Was PPARγ betrifft, so regulierte DBT in einer Konzentration von 1 g/kg KG/d die Expression seiner mRNA herunter (Abbildung 5(a)). Diese Herabregulierung war ähnlich wie die durch E2 induzierte. Eine Wirkung, die eindeutig unabhängig von den potenziellen östrogenen Eigenschaften von DBT war, war hingegen die ausgeprägte Herabregulierung der PPARδ-mRNA-Expression durch beide DBT-Dosen (Abbildung 5(a)). Diese Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, dass DBT die Expression von Rezeptoren regulieren könnte, die an der Regulierung der Verfügbarkeit und des Verbrauchs von Energie aus Fett durch die Modulation der Expression der Rezeptoren der PPAR-Familie beteiligt sind. Als mögliche Verbindung zu den Komplikationen des metabolischen Syndroms ist die Regulierung des Cholesterinstoffwechsels von Interesse. Wir haben daher die Regulation der Expression von Apo-A1 mRNA untersucht. Das Expressionsmuster deutet auf eine östrogenähnliche Eigenschaft von DBT in der Konzentration von 1 g/kg KG/d hin, das wie E2 die Apo-A1 mRNA-Expression herunterreguliert.

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Abbildung 5

Die Genexpression von Peroxisom-Proliferator-aktivierten Rezeptoren und Apo-A1 in Lebern. (a) Die mRNA-Expression von PPARα, PPARγ und PPARδ in Lebern wurde durch quantitative Echtzeit-PCR-Analyse analysiert. (b) Die mRNA-Expression von Apo-A1 in Lebern wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR-Analyse untersucht. Asterisken zeigen Werte an, die sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen unterscheiden. , , und .

3.4. Die Regulierung von DBT auf den Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Weg in Gebärmutter und Leber

Eine effiziente Entgiftung ist ebenfalls entscheidend für die Gesundheit. Es ist bekannt, dass der Arylkohlenwasserstoffrezeptor (AHR) die Expression von metabolisierenden/entgiftenden Enzymen in der Leber und anderen Geweben auslöst, die in einer koordinierten Weise mit der Batterie von Nrf2-regulierten Enzymen wirken. Hier untersuchten wir die Expression von AhR, AhR-Familienmitgliedern und auf AhR reagierenden Genen in Gebärmutter und Leber durch DBT im Vergleich zu E2. Insgesamt konnten wir eine gewebespezifische Regulierung der Expression von AhR, Mitgliedern der AhR-Familie und Reaktionsgenen nach der Behandlung mit DBT feststellen.

In der Gebärmutter wurde die AhR-mRNA-Expression als Reaktion auf E2 stark herunterreguliert, während als Reaktion auf DBT keine Veränderung zu erkennen war (Abbildung 6(a)). Die Expression von Aryl-Kohlenwasserstoff-Rezeptor-Nukleartranslokator 1 (ARNT 1) mRNA, dem Koregulator von AHR, wurde durch E2 herunterreguliert, während DBT in der hohen Dosis zu einer Hochregulierung der ARNT1 mRNA-Spiegel in diesem Organ führt. Was ARNT2 betrifft, so kam es im Uterus als Reaktion auf die E2-Behandlung zu einer starken Herabregulierung der mRNA-Expression, ein Effekt, der als Reaktion auf DBT nicht nachweisbar war (Abbildung 6(b)). Cytochrom P450 (Familie 1) A1 (Cyp1A1) und Glutathion-S-Transferasen Ya (GST-Ya) gelten als sehr empfindliche Reaktionsgene für die AhR-Funktion. Die Cyp1A1-mRNA-Spiegel im Uterus wurden durch E2 stark herunterreguliert, ein Effekt, der auch als Reaktion auf beide DBT-Dosen nachweisbar war, allerdings in geringerem Maße (Abbildung 6(c)). Die mRNA-Expression von GST-Ya wurde nur in Reaktion auf E2 hochreguliert. Die Behandlung mit DBT in beiden Dosierungen hatte keinen Einfluss auf die GST-Ya mRNA-Expression im Uterus (Abbildung 6(c)).

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Abbildung 6

Regulation der Expression von AhR-verwandten Genen in Uteri. (a) Die mRNA-Expression von AhR in der Gebärmutter, (b) die mRNA-Expression von ARNT1 und ARNT2 in der Gebärmutter und (c) die mRNA-Expression von Cyp1A1 und GST-Ya in der Gebärmutter wurden durch semiquantitative Echtzeit-PCR-Analyse analysiert. Asterisken zeigen Werte an, die sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen unterscheiden.

In der Leber war eine leichte, statistisch nicht signifikante Hochregulierung der AhR mRNA als Reaktion auf die E2-Behandlung nachweisbar, während DBT die AhR mRNA-Expression um mehr als das Dreifache steigerte (Abbildung 7(a)). Der mRNA-Spiegel von ARNT1 konnte nur durch die niedrige DBT-Dosis induziert werden, nicht aber durch E2 und die hohe DBT-Dosis. Darüber hinaus schienen alle drei Behandlungen die mRNA-Expression von ARNT2 hochzuregulieren; allerdings erreichte keiner der Werte das Niveau einer statistischen Signifikanz (Abbildung 7(b)). Die E2-Behandlung führte zu einer leichten, aber nicht signifikanten Hochregulierung der Cyp1A1-mRNA-Spiegel, während DBT die Cyp1A1-mRNA-Expression dosisabhängig herunterreguliert. Im Gegensatz dazu führte die E2-Behandlung nicht zu einer Veränderung der mRNA-Expression von GST-Ya, während DBT in hoher Dosis die GST-Ya-mRNA-Expression in einer statistisch signifikanten, dosisabhängigen Weise herunterregulierte (Abbildung 7(c)).

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Abbildung 7

Regulation der Expression von AhR-verwandten Genen in der Leber. (a) Die mRNA-Expression von AhR in der Leber, (b) die mRNA-Expression von ARNT1 und ARNT2 in der Leber und (c) die mRNA-Expression von Cyp1A1 und GST-Ya in der Leber wurden durch semiquantitative Echtzeit-PCR-Analyse analysiert. Asterisken zeigen Werte an, die sich signifikant von den jeweiligen Kontrollen unterscheiden.

4. Diskussion

Obwohl DBT in vitro potenziell östrogene Wirkungen zeigte, sind die Informationen über potenzielle hormonelle Aktivitäten von DBT in vivo begrenzt. Es ist bekannt, dass die Proliferation von Endometriumzellen unter der Kontrolle von Östrogenen steht und dass das Risiko eines Endometriumkarzinoms mit einer Östrogenersatztherapie steigt. Da Naturstoffe mit östrogenähnlichen Aktivitäten in vivo häufig organselektive Eigenschaften aufweisen, haben wir das uterotrophe Experiment organabhängig durchgeführt. Wir bewerteten die potenziellen Auswirkungen von DBT in der Gebärmutter als einem Organ des Fortpflanzungstrakts, das ein klassisches Zielorgan der Östrogenwirkung darstellt, und in der Leber als dem wichtigsten Stoffwechselort, der eines der Organe ist, die ERα überwiegend exprimieren. Um den Einfluss von DBT in Abwesenheit von endogenem Östrogen zu untersuchen, verwendeten wir ovarektomierte weibliche Ratten, um die ER-Selektivität von DBT in Gebärmutter und Leber zu bewerten.

Die Ergebnisse zeigten, dass DBT bei keiner der untersuchten Dosen das Feuchtgewicht von Gebärmutter und Leber oder das Ausmaß der Expression von Proliferationsmarkern und ERs veränderte. Für die ER-Wirkung in der Gebärmutter sind einige sehr empfindliche Markergene bekannt, die östrogene Reaktionen auffangen, nämlich die Hochregulierung von C3 und CaBP9k und die Herunterregulierung von Clu. C3 und CaBP9k konnten durch E2 hochreguliert werden, während Clu als Reaktion auf die E2-Behandlung in der Gebärmutter herunterreguliert wurde. DBT ahmte die östrogenen Reaktionen auf C3 und CaBP9k in sehr geringem Maße nach, nicht jedoch auf Clu. Dies ist interessant, da an der Hochregulierung von C3 und CaBP9k ERE-Antwort-Elemente beteiligt sind, während der genaue Mechanismus der ER-vermittelten Herunterregulierung von Clu nicht bekannt ist. In Anbetracht der im Clu-Promotor enthaltenen Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen ist jedoch eine Beteiligung von SP1- und AP-vermittelten Prozessen wahrscheinlich. Parallel dazu wurden die Veränderungen der Expression von CaBP9k und IGFBP1 in der Leber als Marker für die Östrogenreaktion ermittelt, obwohl die Gesamtreaktion weitaus geringer war als die für CaBP9k oder C3 im Uterus nachweisbare. In der Leber zeigte DBT im 3-Tage-uterotrophen Assay erneut schwache östrogene Eigenschaften. Effekte waren nur mit den empfindlichsten Genexpressionsmarkern für die Östrogenwirkung nachweisbar.

Die Leber ist außerdem ein wichtiger Ort für den Fettstoffwechsel, der mit Fettleibigkeit in Verbindung gebracht wird und der wiederum ein Risikofaktor für Krankheiten in hormonabhängigen Organen wie Brustkrebs ist. Wir untersuchten daher die Expression von Apo-A1, dem Hauptbestandteil von HDL-Cholesterin, und von PPAR-Rezeptoren, die auf verschiedene Weise an der Regulierung des Energiestoffwechsels beteiligt sind. Sie sind auch bekannte Ziele für Naturstoffe, und die Bindung an sie verbessert z. B. die Glukoseaufnahme. Unsere Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, dass die DBT durch die Modulation der Expression der Rezeptoren der PPAR-Familie zur Regulierung der Verfügbarkeit und Nutzung von Energie aus Fett beitragen kann. Zahlreiche Übersichtsarbeiten fassen die Regulierung von Stoffwechselwegen nach der Aktivierung von PPARs zusammen, ein Thema, das in dieser Arbeit nicht im Mittelpunkt steht. Zwei Merkmale unserer Ergebnisse in Bezug auf PPAR verdienen jedoch eine Diskussion. Es wurde eine starke Herabregulierung von PPARδ als Reaktion auf die DBT beobachtet. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erwähnen, dass PPARδ auf die DBT-Behandlung anscheinend unabhängig von Östrogen/ER reagierte. Die funktionellen Konsequenzen der Herabregulierung der PPARδ-Expression durch DBT müssen an dieser Stelle offen bleiben; sie ist jedoch nicht auf eine autoregulatorische Herabregulierung von PPARδ nach Bindung von DBT-Bestandteilen zurückzuführen, da DBT weder PPARδ noch die PPARγ-abhängige Reportergenaktivierung in einem Transient-Transfektionsassay stimulierte (Daten nicht gezeigt). Die Aktivierung einer PPARδ-abhängigen Signalkaskade durch DBT wäre jedoch interessant, da PPARδ der Hauptregulator für die Mobilisierung von Fett und den Energieverbrauch aus Fett ist und aufgrund dieses Phänotyps möglicherweise mit Adipositas und deren Prävention in Verbindung steht.

Im Gegensatz dazu reagierte PPARγ zumindest bei einer hohen DBT-Dosis auf östrogenähnliche Weise, indem es herunterreguliert wurde. Eine wichtige Eigenschaft von PPARγ neben seinen insulinsensibilisierenden Eigenschaften ist, dass es das Stammzellschicksal von mesenchymalen Stammzellen bestimmt. Die skelettalen Wirkungen von PPARγ sind inzwischen gut belegt. Es aktiviert die adipogene Differenzierung und hemmt dadurch die osteogene Differenzierung. Diese Situation wäre für Frauen in den Wechseljahren von Nachteil, weshalb eine Herabregulierung von PPARγ durch DBT auf eine positive Wirkung hindeuten könnte.

Es ist seit langem bekannt, dass der AhR-Signalweg die Expression von metabolisierenden Enzymen in der Leber und in anderen Geweben auslöst, meist in koordinierter Weise mit der Batterie von Nrf2-regulierten Enzymen, und so zum Entgiftungsprozess beiträgt. Wir haben kürzlich gezeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Östrogenfunktion und der Regulierung von AhR und Mitgliedern der AhR-Signalkaskade in der Gebärmutter besteht. Daher untersuchten wir vergleichend die Regulierung der Expression von AhR, AhR-Familienmitgliedern und AhR-Antwortgenen in Gebärmutter und Leber durch DBT im Vergleich zu Estradiol. Zunächst bestätigten wir das östrogene Reaktionsmuster der Mitglieder der AhR-Genbatterie. Für die DBT-Behandlung konnten wir insgesamt eine gewebespezifische Regulierung der Expression von AhR, AhR-Familienmitgliedern und Reaktionsgenen nach der Behandlung mit DBT feststellen. Cyp1A1 und GST-Ya gehören nicht nur zu den Stoffwechselenzymen des ersten (Cyp1A1) und zweiten Durchgangs (GST-Ya), sondern gelten auch als sehr empfindliche Reaktionsgene in Bezug auf Crosstalk-Mechanismen, an denen AhR- und ER-Signalwege beteiligt sind, und wurden auch hier getestet. Interessanterweise zeigte die DBT-Behandlung ein östrogenähnliches Reaktionsmuster für die Regulierung der Cyp1A1-Expression, nicht aber für GST-Ya, was darauf hindeutet, dass die DBT-Funktion in der Leber sowohl mit östrogenähnlichen als auch mit östrogenunabhängigen Eigenschaften verbunden ist. Das Gleiche gilt vermutlich für die durch AhR ausgelösten Reaktionen. Für die Zukunft wird es interessant sein zu sehen, ob DBT und/oder seine Bestandteile AhR-vermittelte Reportergen-Aktivitäten auslösen.

Außerdem fanden wir, wenn auch nur schwach, dass ARNT-Moleküle durch DBT in der Leber hochreguliert werden. Dies ist insofern interessant, als einige der an dieser Arbeit beteiligten Autoren vor kurzem die Hochregulierung von HIF1α durch DBT beschrieben haben, die letztlich zur Hochregulierung von Erythropoietin führt. ARNT1 wird auch als HIF1β bezeichnet und stellt den heterodimeren Dimerisierungspartner von HIF1α bei der Vermittlung seiner Kernreaktionen dar. Mit anderen Worten, wir zeigen hier, dass DBT nicht nur HIF1α, sondern auch HIF1β/ARNT1 hochreguliert und damit möglicherweise die Wirkung von HIF1α auf die Erythropoese unterstützt.

Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass DBT die mRNA-Spiegel von Mitgliedern der AhR-Signalkaskade reguliert und dabei sowohl östrogenähnliche als auch östrogenrezeptorunabhängige Aktivitäten aufweist, was vermutlich zu einem unterschiedlichen Muster von Entgiftungsmechanismen führt. Das letzte wichtige Ergebnis war, dass die Auswirkungen der DBT offenbar organselektiv sind und Funktionen beeinflussen, die für die Gesundheit in den Wechseljahren relevant sind. Was die Sicherheit betrifft, gab es keine Hinweise auf eine östrogenabhängige Stimulation der Proliferation in den Organen des Fortpflanzungstraktes. Hinsichtlich der Wirksamkeit weist DBT schwache östrogene Eigenschaften auf und reguliert die Expression funktionell miteinander verbundener Lipidsensoren, zu denen unter anderem die PPAR- und AhR-Molekülfamilien gehören, wobei letztere eine Verbindung zur Entgiftung und zum Energiestoffwechsel herstellen. Wir stellen die Hypothese auf, dass DBT daher Eigenschaften haben könnte, die sich direkt und indirekt auf die Gesundheit in den Wechseljahren auswirken.

Abkürzungen

Interessenkonflikt

Die Autoren erklären, dass es keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit der Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Danksagungen

Diese Forschung wurde unterstützt durch Stipendien des Research Grants Council of Hong Kong (HKUST 6419/06 M und N_HKUST629/07, 662608), der Croucher Foundation (CAS-CF07/08.SC03) an Karl W. K. Tsim und der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG Vo410/6-5) und des Deutschen Akademischen Austauschdienstes (DAAD 50023165) an Günter Vollmer. Die Mitarbeiter der TU-Dresden bedanken sich für die Unterstützung durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft und den Open-Access-Publikationsfonds der TU-Dresden.

Ergänzendes Material