Die Möglichkeit, eine Korrelation zwischen zwei Biomolekülen nachzuweisen, wurde durch Erik Manders von der Universität Amsterdam erheblich verbessert, der den Mikroskopikern den Pearsonschen Korrelationskoeffizienten und andere Koeffizienten vorstellte, von denen sich die „Überlappungskoeffizienten“ M1 und M2 als die bekanntesten und nützlichsten erwiesen haben. Der Zweck der Verwendung von Koeffizienten besteht darin, den Grad der Überlappung zwischen Bildern zu charakterisieren, in der Regel zwischen zwei Kanälen in einem mehrdimensionalen Mikroskopiebild, das bei verschiedenen Emissionswellenlängen aufgenommen wurde. Ein populärer Ansatz wurde von Sylvain Costes eingeführt, der den Korrelationskoeffizienten von Pearson als Instrument zur objektiven Festlegung der für M1 und M2 erforderlichen Schwellenwerte verwendete. Costes Ansatz geht davon aus, dass nur positive Korrelationen von Interesse sind, und liefert keine brauchbare Messung der PCC.
Obwohl die Verwendung von Koeffizienten die Zuverlässigkeit der Kolokalisationserkennung erheblich verbessern kann, hängt sie von einer Reihe von Faktoren ab, einschließlich der Bedingungen, unter denen die Proben mit Fluoreszenz vorbereitet wurden und wie Bilder mit Kolokalisation aufgenommen und verarbeitet wurden. Studien sollten mit großer Vorsicht und nach sorgfältiger Hintergrundlektüre durchgeführt werden. Derzeit herrscht auf diesem Gebiet noch Verwirrung, und ein standardisierter Ansatz ist noch nicht fest etabliert. Zu den Versuchen, hier Abhilfe zu schaffen, gehören die erneute Prüfung und Überarbeitung einiger Koeffizienten, die Anwendung eines Faktors zur Korrektur des Rauschens, „Replikat-basierte rauschkorrigierte Korrelationen für genaue Messungen der Kolokalisation“ und der Vorschlag weiterer Protokolle, die von Bolte und Cordelieres (2006) gründlich überprüft wurden. Da Fluoreszenzbilder dazu neigen, ein gewisses Maß an unscharfen Signalen, Poisson Shot und anderem Rauschen zu enthalten, müssen sie vor der Quantifizierung in der Regel aufbereitet werden. Eine sorgfältige Bildrestaurierung durch Entfaltung entfernt das Rauschen und erhöht den Kontrast der Bilder, wodurch die Qualität der Ergebnisse der Kolokalisationsanalyse verbessert wird. Die bisher am häufigsten verwendeten Methoden zur Quantifizierung der Kolokalisierung berechnen die statistische Korrelation der Pixelintensitäten in zwei verschiedenen Mikroskopiekanälen. Neuere Studien haben gezeigt, dass dies zu hohen Korrelationskoeffizienten führen kann, selbst bei Zielen, von denen bekannt ist, dass sie sich in verschiedenen zellulären Kompartimenten befinden. Eine robustere Quantifizierung der Kolokalisierung kann durch eine Kombination aus digitaler Objekterkennung, Berechnung der Flächenüberlappung und Kombination mit einem Pixel-Intensitätskorrelationswert erreicht werden. Dies führte zu dem Konzept eines objektkorrigierten Pearson-Korrelationskoeffizienten
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