Innerhalb von drei Wochen nach seinem Sieg wurden die Gründungsriten von Neu-Rom vollzogen, und die stark vergrößerte Stadt wurde am 11. Mai 330 offiziell eingeweiht. Es war ein Akt von großer historischer Tragweite. Konstantinopel sollte eine der großen Hauptstädte der Welt werden, eine Quelle kaiserlicher und religiöser Macht, eine Stadt von unermesslichem Reichtum und Schönheit und die wichtigste Stadt der westlichen Welt. Bis zum Aufstieg der italienischen Seestaaten war Konstantinopel die erste Handelsstadt und die Hauptstadt dessen, was bis zur Mitte des 11. Jahrhunderts die stärkste und prestigeträchtigste Macht in Europa war.
Die Wahl Konstantins als Hauptstadt hatte tiefgreifende Auswirkungen auf die griechische und römische Welt. Er verlagerte das Machtzentrum des Römischen Reiches nach Osten und erreichte die erste dauerhafte Einigung Griechenlands. Kulturell förderte Konstantinopel eine Verschmelzung von orientalischen und abendländischen Bräuchen, Kunst und Architektur. Die Religion war christlich, die Organisation römisch und die Sprache und Weltanschauung griechisch. Das Konzept des göttlichen Rechts der Könige, d. h. von Herrschern, die Verteidiger des Glaubens waren – im Gegensatz zum König als göttlichem Wesen selbst – wurde hier entwickelt. Der Goldsolidus von Konstantin behielt seinen Wert und diente mehr als tausend Jahre lang als Währungsstandard. Im Laufe der Jahrhunderte – das christliche Reich dauerte 1.130 Jahre – sollte Konstantinopel, der Sitz des Reiches, so wichtig werden wie das Reich selbst; am Ende, obwohl die Territorien praktisch geschrumpft waren, blieb die Hauptstadt bestehen.
Die neuen Stadtmauern Konstantins verdreifachten die Größe von Byzanz, das nun kaiserliche Gebäude wie das von Septimius Severus begonnene Hippodrom, einen riesigen Palast, Säle für die Gesetzgebung, mehrere imposante Kirchen und Straßen mit einer Vielzahl von Statuen aus rivalisierenden Städten enthielt. Zusätzlich zu den anderen Attraktionen der Hauptstadt wurden denjenigen Siedlern, die die leeren Gebiete jenseits der alten Mauern besiedelten, kostenloses Brot und das Bürgerrecht gewährt. Darüber hinaus waren die Christen willkommen, andere Glaubensrichtungen wurden toleriert, und den Juden wurde Wohlwollen entgegengebracht.
Konstantinopel war auch ein kirchliches Zentrum. Im Jahr 381 wurde es zum Sitz eines Patriarchen, der nur dem Bischof von Rom untergeordnet war; der Patriarch von Konstantinopel ist noch immer das nominelle Oberhaupt der orthodoxen Kirche. Konstantin leitete die ersten ökumenischen Konzilien ein; die ersten sechs fanden in oder bei Konstantinopel statt. Im 5. und 6. Jahrhundert waren die Kaiser damit beschäftigt, Mittel zu finden, um die Monophysiten an das Reich zu binden. Im 8. und 9. Jahrhundert war Konstantinopel das Zentrum des Kampfes zwischen den Ikonoklasten und den Verteidigern der Ikonen. Die Angelegenheit wurde auf dem siebten ökumenischen Konzil gegen die Ikonoklasten beigelegt, aber nicht bevor viel Blut vergossen und unzählige Kunstwerke zerstört worden waren. Der östliche und der westliche Flügel der Kirche entfernten sich immer weiter voneinander, und nach jahrhundertelangen lehrmäßigen Meinungsverschiedenheiten zwischen Rom und Konstantinopel kam es im 11. Der Papst hatte die Plünderung Konstantinopels 1204 zunächst gebilligt und dann abgelehnt. Angesichts der türkischen Bedrohung der Stadt wurden verschiedene Versuche unternommen, den Bruch zu heilen, aber die trennenden Kräfte des Misstrauens und der Lehrdivergenz waren zu stark.
Am Ende des 4. Jahrhunderts waren die Mauern Konstantins zu eng geworden für die reiche und bevölkerungsreiche Metropole. Der heilige Johannes Chrysostomus schrieb am Ende des Jahrhunderts, dass viele Adlige 10 bis 20 Häuser besaßen und 1 bis 2.000 Sklaven hatten. Die Türen waren oft aus Elfenbein, die Fußböden bestanden aus Mosaik oder waren mit kostbaren Teppichen bedeckt, und die Betten und Liegen waren mit Edelmetallen überzogen.
Der Bevölkerungsdruck von innen und die barbarische Bedrohung von außen veranlassten den Bau von Mauern weiter im Landesinneren am äußersten Ende der Halbinsel. Diese neuen Mauern aus dem frühen 5. Jahrhundert, die unter Theodosius II. errichtet wurden, stehen noch heute.
Unter Justinian I. (527-565) erreichte das mittelalterliche Konstantinopel seinen Zenit. Zu Beginn dieser Herrschaft wird die Bevölkerung auf etwa 500.000 Menschen geschätzt. Im Jahr 532 wurde ein großer Teil der Stadt niedergebrannt und ein Großteil der Bevölkerung bei der Niederschlagung des Nika-Aufstandes, eines Aufstandes der Hippodrom-Fraktionen, getötet. Der Wiederaufbau der verwüsteten Stadt gab Justinian die Gelegenheit, ein großartiges Bauprogramm in Angriff zu nehmen, von dem noch viele Gebäude erhalten sind.
Im Jahr 542 wurde die Stadt von einer Pest heimgesucht, die drei von fünf Einwohnern getötet haben soll; der Niedergang Konstantinopels geht auf diese Katastrophe zurück. Nicht nur die Hauptstadt, sondern das gesamte Reich verfiel, und erst im 9. Jahrhundert war eine langsame Erholung zu erkennen. In dieser Zeit wurde die Stadt häufig belagert – von den Persern und Awaren (626), den Arabern (674 bis 678 und erneut von 717 bis 718), den Bulgaren (813 und 913), den Russen (860, 941 und 1043) und einem wandernden Turkvolk, den Peschenegen (1090-91). Alle waren erfolglos.
Im Jahr 1082 wurden den Venezianern Quartiere in der Stadt selbst zugewiesen (zuvor gab es ein Quartier für ausländische Händler in Galata auf der anderen Seite des Goldenen Horns) mit besonderen Handelsprivilegien. Später schlossen sich ihnen Pisaner, Amalfiter, Genueser und andere an. Diese italienischen Gruppen erlangten bald einen Würgegriff über den Außenhandel der Stadt – ein Monopol, das schließlich durch ein Massaker an Italienern gebrochen wurde. Erst nach einiger Zeit durften sich italienische Händler wieder in Galata niederlassen.
Im Jahr 1203 erschienen die Armeen des Vierten Kreuzzugs, die von ihrem Ziel im Heiligen Land abgelenkt worden waren, vor Konstantinopel – angeblich, um den rechtmäßigen byzantinischen Kaiser Isaak II. wiederherzustellen. Obwohl die Stadt fiel, blieb sie ein Jahr lang unter ihrer eigenen Regierung. Am 13. April 1204 stürmten die Kreuzfahrer die Stadt und plünderten sie. Nach einem allgemeinen Massaker dauerte die Plünderung noch jahrelang an. Die Kreuzritter setzten einen von ihnen, Baldwin von Flandern, als Kaiser ein, und die Venezianer – die Hauptinitiatoren des Kreuzzuges – übernahmen die Kontrolle über die Kirche. Während die Lateiner den Rest des Reiches unter sich aufteilten, verschanzten sich die Byzantiner jenseits des Bosporus in Nizäa (heute İznik) und in Epirus (heute Nordwestgriechenland). Die Zeit der lateinischen Herrschaft (1204 bis 1261) war die katastrophalste in der Geschichte Konstantinopels. Sogar die Bronzestatuen wurden für Münzen eingeschmolzen, alles Wertvolle wurde entwendet. Heilige Reliquien wurden aus den Heiligtümern gerissen und an religiöse Einrichtungen in Westeuropa verschickt.
Im Jahr 1261 wurde Konstantinopel von Michael VIII. (Palaeologus), dem griechischen Kaiser von Nizäa, zurückerobert. In den nächsten zwei Jahrhunderten führte das geschrumpfte byzantinische Reich, das sowohl vom Westen als auch von der aufstrebenden Macht der osmanischen Türken in Kleinasien bedroht war, eine prekäre Existenz. Im späten 13. und frühen 14. Jahrhundert wurden einige Baumaßnahmen durchgeführt, doch danach verfiel die Stadt, war voller Ruinen und verödeter Flächen und stand im Gegensatz zu dem blühenden Galata auf der anderen Seite des Goldenen Horns, das der byzantinische Herrscher Michael VIII. den Genuesen geschenkt hatte. Als die Türken in der Mitte des 14. Jahrhunderts nach Europa vordrangen, war das Schicksal Konstantinopels besiegelt. Das unvermeidliche Ende wurde durch die Niederlage der Türken gegen Timur (Tamerlane) im Jahr 1402 hinausgezögert, aber 1422 belagerte der osmanische Sultan der Türkei, Murad II, Konstantinopel. Dieser Versuch scheiterte und wurde erst 30 Jahre später wiederholt. Im Jahr 1452 begann ein anderer osmanischer Sultan, Mehmed II., den Bosporus zu blockieren, indem er an seiner engsten Stelle eine starke Festung errichtete; diese Festung, Rumelihisarı genannt, ist noch immer eines der wichtigsten Wahrzeichen der Meerenge. Die Belagerung der Stadt begann im April 1453. Die Türken hatten nicht nur eine überwältigende zahlenmäßige Überlegenheit, sondern auch Kanonen, die die alten Mauern durchbrachen. Das Goldene Horn war durch eine Kette geschützt, aber dem Sultan gelang es, seine Flotte auf dem Landweg vom Bosporus ins Goldene Horn zu ziehen. Der letzte Angriff erfolgte am 29. Mai, und trotz des verzweifelten Widerstands der Einwohner, die von den Genuesen unterstützt wurden, fiel die Stadt. Der letzte byzantinische Kaiser, Konstantin XI. (Palaeologus), wurde in der Schlacht getötet. Drei Tage lang war die Stadt der Plünderung und dem Gemetzel preisgegeben, dann stellte der Sultan die Ordnung wieder her.