Rajskubs erste Rolle war die eines Oompa-Loompa in einer Theaterproduktion von Willy Wonka & Die Schokoladenfabrik, und ihre erste Hauptrolle war Raggedy Ann. 1996 trat sie in Musikvideos zu den Songs „The Good Life“ von Weezer und „The New Pollution“ von Beck auf.
Von 1996-1998 hatte sie eine wiederkehrende Rolle in der HBO-Serie The Larry Sanders Show als Buchungsassistentin Mary Lou Collins.
Ihre bekannteste Rolle ist die der CTU-Systemanalytikerin Chloe O’Brian in 24, zu der sie 2003 zu Beginn der dritten Staffel der Serie stieß. Ihre Figur war ein Hit bei Zuschauern und Kritikern und war eines der wenigen Mitglieder der Besetzung, die in der vierten Staffel der Serie zurückkehrten. Nachdem sie zwei Staffeln lang ein regelmäßiger Gaststar war, wurde Rajskub in der fünften Staffel der Serie zum Hauptdarsteller. Am Ende der Serie war sie die weibliche Hauptrolle, die nach Kiefer Sutherland die größte Aufmerksamkeit auf sich zog. Ihrer Figur wurde auch die Ehre zuteil, im Serienfinale von Staffel 8 die letzten Worte der Serie zu sprechen. Rajskub und Sutherland traten 2007 in einer Episode der Fox-Zeichentrickserie Die Simpsons kurz als ihre 24 Charaktere auf: „24 Minuten“. Im August 2013 wurde bekannt gegeben, dass sie ihre Rolle der Chloe O’Brian in der 2014 ausgestrahlten Serie 24: Live Another Day wieder aufnehmen würde.
Rajskub war eines der ursprünglichen Mitglieder der Besetzung von Mr. Show. Sie trat in Kelsey Grammers The Sketch Show auf Fox Television, The King of Queens als Figur namens Priscilla und in zahlreichen Filmen auf, darunter Mysterious Skin, Legally Blonde 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, Musikvideos für Beck, Weezer und Sheryl Crow sowie die Darstellung einer blinden Frau in dem Film Road Trip.
Rajskub war Teil eines Comic-Duos (mit Karen Kilgariff) namens Girls Guitar Club. 2006 hatte sie einen Cameo-Auftritt in „Partings“, dem Finale der 6. Staffel von Gilmore Girls, wo sie eine Trobairitz spielte, die auf ihren großen Durchbruch wartet. (Rajskub hatte zuvor in Gilmore Girls die weibliche Hauptrolle in A Film by Kirk gespielt, einem Kurzfilm, der von der Figur Kirk Gleason gedreht wurde). Sie hat sich freiwillig als Schauspielerin für das Young Storytellers Program gemeldet. Sie hat eine Ausbildung als Malerin und besuchte das San Francisco Art Institute.
Rajskub wurde zweimal für einen Screen Actors Guild Award nominiert, einmal 2005 und erneut 2007 für die herausragende Leistung eines Ensembles in einer Dramaserie. Sie hatte einen Gastauftritt in der Folge „Prime Minister“ von Flight of the Conchords als Karen, eine Art Garfunkel-Fanatikerin. Sie hatte einen Gastauftritt als „Gail the Snail“ in einer Folge von It’s Always Sunny in Philadelphia mit dem Titel „The Gang Gives Frank an Intervention“ und spielte die Rolle erneut im Finale der neunten Staffel, „The Gang Squashes Their Beefs“, und in der Folge „The Gang Beats Boggs“ der dreizehnten Staffel: Ladies Reboot“. Im Jahr 2009 trat sie auch in dem Film Julie & Julia als Sarah auf, eine von Julie Powells engen Freundinnen. 2010 trat Rajskub als Stand-up-Künstlerin in John Olivers New York Stand Up Show auf. Im Juni 2010 trat sie in der Episode „Lovesick“ in der zweiten Staffel der US-Serie Royal Pains auf.
Von Juli bis Oktober 2010 trat sie in ihrer Soloshow Mary Lynn Spreads Her Legs am Steve Allen Theater in Los Angeles auf. Die Kritikerin F. Kathleen Foley von der Los Angeles Times schrieb: „Der fröhlich-vulgäre Titel fasst den allgemeinen Ton zusammen, der oft leicht obszön ist“. Die Show wurde von Rajskub mit Hilfe des Regisseurs und Entwicklers Amit Itelman geschrieben und von Rajskubs Erfahrungen mit Schwangerschaft, Geburt und früher Mutterschaft inspiriert.
Im Januar 2011 hatte Rajskub eine Gastrolle in der Episode „Our Children, Ourselves“ in der zweiten Staffel von ABC’s Modern Family. Im Herbst 2011 trat Rajskub in der kurzlebigen Sitcom How to Be a Gentleman auf. Ebenfalls 2011 begann die Ausstrahlung von Rajskubs Webserie Dicki auf My Damn Channel. Dicki basiert auf einer Reihe von Personen, mit denen Rajskub in und um Michigan aufgewachsen ist. Die Titelfigur ist eine 40-jährige Frau, die zu Hause bei ihren Eltern lebt, handwerklich tätig ist und ihre Kunst ernst nimmt. Dicki war bisher eine der erfolgreichsten Webserien von My Damn Channel. Die erste Staffel endete im November 2011, aber eine zweite Staffel ist derzeit in Entwicklung. Rajskub trat im Juni 2012 in der Ausgabe von Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling) auf, einer monatlichen Show, in der Prominente wahre Geschichten erzählen, von denen sie nicht wollen, dass ihre Mütter sie erfahren. Derzeit ist sie Gastgeberin eines Podcasts auf dem Nerdist Network mit dem Titel Kickin‘ it Mary Lynn Style.
Im Jahr 2013 erschien Rajskub in der vierten Staffel von Arrested Development in einer stillen, aber gut aufgenommenen Rolle als Heartfire, einer Figur, von der Rajskub sagt, dass sie „aus dem Herzen spricht, aber keine Worte benutzt.“ Im selben Jahr trat Rajskub auch in der Webserie All Growz Up mit Melinda Hill auf.
Rajskub erschien am 27. März 2015 in Ken Reids TV Guidance Counselor-Podcast.
Im August 2016 trat Rajskub beim Edinburgh Festival Fringe in 24 Hours With Mary Lynn Rajskub auf und wurde von Fans und Kritikern gut aufgenommen.
Im Jahr 2017 trat Rajskub in der ersten Staffel der Adult Swim-Serie Dream Corp LLC auf und spielte Patient 46 in der Episode „Are You Down With OCD?“.
Im Jahr 2018 trat Rajskub in Night School an der Seite von Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe und Keith David auf.
Im Jahr 2021 veröffentlichte Rajskub ein 49-minütiges Comedy-Special namens Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; es kann über verschiedene Video-on-Demand-Dienste ausgeliehen oder gekauft werden.