4.3 Vom Linsenvesikel zur reifen Linse
Das Linsenvesikel bildet sich, indem es die Linsentasse (auch Linsengrube genannt) schließt und sich vom Oberflächenektoderm ablöst. Ein Zwischenschritt ist die Entwicklung eines Linsenstiels, der das geschlossene Vesikel und das Oberflächenektoderm für einige Stunden zusammenhält (bei der Maus). Die Linsenblase ist nahezu kugelförmig mit einem großen zentralen Hohlraum; die Zellen an ihrem hinteren Pol verlängern sich, bis sie die vorderen Epithelzellen erreichen und die gesamte Linsenblase ausfüllen; diese verlängerten Zellen werden als primäre Linsenfaserzellen bezeichnet. Dieser Schritt erfolgt beim menschlichen Embryo um den 44. Tag der Trächtigkeit, bei der Maus um E11,5 (Abb. 10.5). Die Zellen am vorderen Pol des Linsenvesikels bleiben als Epithelzellen erhalten. Mitotisch aktive Zellen, die die zentrale Region des Linsenepithels umgeben, wandern in die äquatoriale Region (oder Linsenbogenregion), wo sie sich verlängern und zu sekundären Linsenfasern differenzieren. Die Mittellinie, an der sekundäre Linsenfasern von gegenüberliegenden Punkten des Äquators zusammenlaufen, wird als vordere und hintere Linsennaht bezeichnet. Die sekundären Linsenfasern bilden konzentrische Schichten um die primären Fasern des Linsenkerns (bei der Maus am Tag E15,5; Abb. 10.5). Bei dieser Anordnung sind die Linsenfasern zur Peripherie hin entwicklungs- und differenzierungstechnisch sukzessive jünger. Solange die Linse wächst, wandern neue sekundäre Fasern vom Äquator aus in den äußeren Kortex der Linse ein.
Abbildung 10.5. Bildung der Linse. Sobald sich das Linsenbläschen gebildet hat, strecken sich die primären Linsenfasern aus dem hinteren Epithel des Linsenbläschens und füllen dessen gesamtes Lumen aus. Die sekundären Faserzellen beginnen sich im Bereich des Linsenbogens zu verlängern; die Fasern von gegenüberliegenden Seiten treffen sich am vorderen und hinteren Pol und bilden die Linsennähte (die in der dreidimensionalen Ansicht Y-förmig sind). Der letzte Schritt der Linsendifferenzierung ist der Abbau der Zellkerne und Mitochondrien, der bei der Maus etwa zum Zeitpunkt der Geburt stattfindet (verändert nach Graw, 2003; mit Genehmigung der Nature Publishing Group).
Sowohl die primären als auch die sekundären Faserzellen verlieren ihre Mitochondrien und Zellkerne während des endgültigen Differenzierungsprozesses: für die primären Fasern findet er bei Mäusen um E17/E18 statt und ist 2 Wochen nach der Geburt abgeschlossen, wenn die Mäuse ihre Augenlider öffnen (Vrensen et al, 1991). Die sekundären Faserzellen, die die primären Faserzellen umschließen, verlieren ihre Organellen, wenn sie von der äußeren zur inneren Rinde wandern (Kuwabara und Imaizumi, 1974).
Die vorderen Epithelzellen bleiben jedoch als Stammzellnische mitotisch aktiv und produzieren sekundäre Faserzellen. Diese sekundären Linsenfaserzellen sind terminal differenzierte Zellen und verlieren auch ihre Organellen, wenn sie von den nachfolgenden Faserzellen tiefer in die Linse hineingedrückt werden.
Beim Zebrafisch treten jedoch mehrere Unterschiede in der Linsenentwicklung und -differenzierung auf. Insbesondere erfolgt die Verlängerung der primären Faserzellen kreisförmig, was zu einem embryonalen Linsenkern mit konzentrischen Schalen von Fasern führt. Der sehr enge Abstand zwischen den Kernen der sich differenzierenden Sekundärfasern in einer schmalen Zone nahe dem Äquatorialepithel deutet jedoch darauf hin, dass die Differenzierung der Sekundärfaserzellen von der bei Säugetier- oder Vogellinsen beschriebenen abweicht. Aufgrund dieser Unterschiede sollte man bei der Extrapolation von Erkenntnissen über den Zebrafisch auf die Entwicklung oder Funktion der Linse von Mäusen oder Menschen vorsichtig sein (Dahm et al., 2007).
In Mäusen charakterisieren mindestens zwei Gene, Pitx3 und Foxe3, die Bedeutung der vorübergehenden Natur des Linsenstielstadiums. Bei Mäuseembryonen wird Pitx3 ab E11 in der sich entwickelnden Linse exprimiert, zunächst in der Linsenblase und später im vorderen Epithel und dem Linsenäquator. Mutationen in den regulatorischen oder kodierenden Regionen des Pitx3-Gens haben gezeigt, dass sie den Phänotyp der Aphakie (ak) oder augenlosen (eyl) Mausmutanten verursachen, denen Linsen und Pupillen fehlen (Rieger et al., 2001; Rosemann et al., 2010; Semina et al., 2000). Bei diesen Mäusen bleibt der Linsenstiel für mehrere Tage bestehen, was schließlich zum Abbau der rudimentären Linsenblase führt, und Netzhautgewebe füllt den gesamten Augapfel aus. Da Pitx3 auch in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra exprimiert wird, sind diese Mäuse auch hervorragende Modelle für die Parkinson-Krankheit (Rosemann et al., 2010). Im Gegensatz zur Maus verursachen Mutationen im menschlichen PITX3 eine mesenchymale Dysgenese des vorderen Segments (ASMD; Semina et al., 1998).
Die ak/ak-Mäuse haben einen okulären Phänotyp, der den dyl-Mäusen (dysgene Linse) sehr ähnlich ist, was darauf hindeutet, dass beide Gene an demselben biologischen Prozess beteiligt sind. Blixt et al. (2000) zeigten, dass der Dyl-Phänotyp durch eine Mutation im Foxe3-Gen vermittelt wird. Bei der Maus wird FoxE3 im sich entwickelnden Auge um E9,5 exprimiert, zu Beginn der Linsenplakodenbildung (Abb. 10.2). Während sich die Linsenplakode bildet, nimmt die Expression von FoxE3 zu und beschränkt sich auf das Linsenvesikel, wenn es sich vom Oberflächenektoderm ablöst. Zwei Mutationen innerhalb der DNA-Bindungsdomäne von FoxE3 wurden in Dyl-Mäusen identifiziert. Beim Menschen sind Mutationen in FOXE3 für die optische Dysgenesie des vorderen Segments (ASOD) verantwortlich. Aufgrund des Expressionsmusters von FOXE3 und des variablen Phänotyps der heterozygoten dyl-Mäuse wurde eine kleine Kohorte von Patienten mit Peters-Anomalie, bei denen keine PAX6-Mutationen nachgewiesen werden konnten, auf FOXE3-Mutationen untersucht. Einer der Patienten erwies sich als heterozygot für eine Arg90Leu-Substitution, die die DNA-Bindungsdomäne von FOXE3 beeinträchtigt (Ormestad et al., 2002).
Der zweite wichtige Schritt ist die Dehnung der Zellen in der hinteren Hälfte des Linsenbläschens, die es mit primären Faserzellen füllen. Bei der Mausmutante „opaque flecks in the lens“ beeinträchtigt eine Punktmutation die Basisregion von Maf (kodiert von einem Onkogen, das für das muskuloaponeurotische Fibrosarkom verantwortlich ist) und verhindert die korrekte Bildung der primären Linsenfasern, was zu einem Phänotyp führt, der dem pulverförmigen Katarakt in einer menschlichen Familie ähnelt (Lyon et al., 2003). MAF wird bei Säugetieren in der Linsenplakode und im Linsenvesikel und später in den primären Linsenfasern exprimiert.
In ähnlicher Weise charakterisierten Puk et al. (2008) kürzlich eine neue, durch Ethylnitrosoharnstoff (ENU) induzierte Mausmutante mit einem Kleinaugenphänotyp und einem leeren Linsenvesikel im homozygoten Zustand. In diesem Fall wurde eine Mutation im Gen Gjf1 (auch als Gje1 bezeichnet) festgestellt. Bei der Maus kodiert das Gen Gjf1 für ein connexinähnliches Protein von 23,8 kDa, das im hinteren Teil des Linsenvesikels exprimiert wird, wo die primäre Faserverlängerung beginnt. In den Mutanten ist das Expressionsmuster von Pax6, Prox1, Six3 und Crygd verändert, nicht jedoch das Muster von Pax2. Das Gen Gjf1 ist vermutlich essentiell für die Bildung der primären Linsenfasern (Puk et al., 2008) und könnte als nachgeschaltetes Ziel des Transkriptionsfaktors c-Maf angesehen werden; Mutationen im entsprechenden Maf-Gen führen bei der Maus zu einem ähnlichen Phänotyp (Lyon et al., 2003; Perveen et al., 2007). Derzeit ist nicht klar, ob es ein funktionelles menschliches Gegenstück zum Gjf1-Gen der Maus gibt.
Ein dritter Phänotyp ohne Verlängerung der primären Linsenfasern wird durch den Knockout des Pparbp-Gens (kodierend für das Peroxisom-Proliferator-Aktivator-Rezeptor-Bindungsprotein; Crawford et al., 2002) verursacht. Die Beziehung zwischen diesen drei funktionell unterschiedlichen Proteinen für die Bildung der primären Linsenfaserzellen ist noch nicht klar.
Neben diesen drei Genen könnte auch die Wnt-Signalisierung eine Rolle bei der Verlängerung der primären Faserzellen spielen. Faber et al. berichteten im Jahr 2002 über eine dominant-negative Form des Bmp-Rezeptors 1b (Gensymbol: Bmpr1b) in transgenen Mäusen. Diese transgenen Mausmutanten zeigen eine Hemmung der Entwicklung der primären Faserzellen, allerdings auf asymmetrische Weise: Sie trat nur auf der nasalen Seite der Linse in der ventralen Hälfte auf. Die Autoren schlossen daraus, dass in verschiedenen Quadranten unterschiedliche Differenzierungsstimuli aktiv sein könnten.
Auf der vorderen Seite bleiben die Linsenepithelzellen die einzigen mitotisch aktiven Zellen in der Linse. Sie zeichnen sich durch eine kontinuierliche Expression mehrerer Wnt-Gene aus: die detaillierten Daten zur Expression unterscheiden sich jedoch nicht nur zwischen Küken und Mäusen, sondern variieren auch zwischen den verschiedenen Mäusestämmen (für Einzelheiten siehe eine Übersicht von de Iongh et al., 2006). Dennoch ist klar, dass die Gene des Wnt-Signalweges vor allem in den Epithelzellen der Linse exprimiert werden. Folgerichtig wurden auch Fzd-Rezeptoren (Gensymbole: Fzd1-8) und Co-Rezeptoren Lrp5 und Lrp6, Sfrp1-3 und Dkk1-3-Gene während der Linsenentwicklung exprimiert. Sie sind hauptsächlich in den Epithelzellen vorhanden; die einzige Ausnahme ist Fzd6, das zunehmend in differenzierenden Faserzellen exprimiert wird (de Iongh et al., 2006). So wurden beispielsweise lrp6-Nullmutanten analysiert, die (neben einigen anderen Defekten; siehe MGI-Datenbank) kleine Augen und aberrante Linsen aufweisen, die durch ein unvollständig ausgebildetes vorderes Epithel gekennzeichnet sind, was zur Extrusion von Linsenfasern in das darüber liegende Hornhautstroma führt (Stump et al., 2003).
Der wichtigste Auslöser für die Differenzierung von Linsenfaserzellen ist jedoch die Fgf-Signalgebung. Eine der bedeutendsten Entdeckungen zeigte in Rattenlinsen-Explantaten, dass unterschiedliche Konzentrationen von Fgf2 (früher bekannt als „basic Fgf“ oder „bFGF“) für die Proliferation, Migration und Differenzierung von Linsenfaserzellen verantwortlich sind (McAvoy und Chamberlain, 1989). Da noch nicht bekannt ist, welche der verschiedenen Fgfs an der Linseninduktion beteiligt sind (Smith et al., 2010), hat sich die Forschung auf die Fgf-Rezeptoren konzentriert. Wie bereits erwähnt, traten bei Linsen, denen drei Fgf-Rezeptor-Gene (Fgfr1-3; Zhao et al., 2008) fehlten, schwere Defekte bei der Dehnung der Linsenfaserzellen auf. Fgf-Signale sind auch für die Aktivierung des nicht-kanonischen Wnt-Signalweges notwendig (d.h., unabhängig von β-Catenin) in Linsenepithelzellen; in Linsenexplantaten führt es zur Akkumulation von β-Crystallin, einem Marker für die Faserzelldifferenzierung (Lyo und Joo, 2004).
Die reife Linse enthält mehrere Klassen von Strukturproteinen: die Kristalline (α-, β-, γ-, δ-, μ-, ζ-Kristalline), Transmembranproteine (wie MP19 und MIP26 und die Connexine 43, 46 und 50), einige Kollagene und Zytoskelett- und Intermediärfilamentproteine. Mutationen in den entsprechenden Genen (oder spezifischen Transkriptionsfaktoren) führen zu Funktionsstörungen und Linsentrübungen (Katarakt). Das Alter, in dem die Katarakte auftreten, und die Art ihrer Vererbung hängen von der Expression der entsprechenden Gene und von dem Bereich ab, der von der zugrunde liegenden Mutation betroffen ist. Insgesamt sind ∼60 verschiedene Gene bekannt, die für die Kataraktbildung bei Mäusen und Menschen verantwortlich sind. Eine detaillierte Diskussion der entsprechenden Mutationen und ihrer funktionellen Konsequenzen würde den Rahmen dieses Kapitels sprengen; entsprechende Übersichtsarbeiten zu diesem Thema wurden kürzlich vom Autor veröffentlicht (Graw, 2009a,b).