Eine Hochregulierung von CAP1, aber eine erhöhte S308/S310-Phosphorylierung, wurde in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen festgestellt
Die CAP1-Proteinkonzentrationen wurden im Western Blotting in einer Reihe von häufig verwendeten Bauchspeicheldrüsenkrebs-Zelllinien {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 und Mia PaCa-229} bestimmt und mit denen in der immortalisierten, aber nicht transformierten Bauchspeicheldrüsenzelllinie hTERT-HPNE30 verglichen, die als Kontrolle dient. Wie in Abb. 1A gezeigt, exprimieren alle vier Krebszelllinien reichlich CAP1, vergleichbar mit den HeLa-Zellen, von denen wir bereits berichteten, dass sie sowohl CAP1 als auch CAP212 reichlich exprimieren. Wir stellten fest, dass die nicht transformierten hTERT-HPNE-Zellen vergleichbare Mengen an CAP1 exprimierten wie die Krebszelllinien. Wir untersuchten auch die Expression der anderen CAP-Isoform, CAP2, und stellten fest, dass PANC-1- und Mia-PaCa-2-Zellen im Vergleich zu den hTERT-HPNE-Zellen eine deutlich erhöhte CAP2-Expression aufwiesen (Abb. 1A).
In Bauchspeicheldrüsenkrebszellen wurde eine erhöhte S308/S310-Phosphorylierung von CAP1, aber keine hochregulierte CAP1-Expression festgestellt. (A) Der Western Blot zeigt, dass in allen vier Krebszelllinien eine hohe CAP1-Expression nachgewiesen wurde, die mit der von HeLa-Zellen vergleichbar ist, während die Kontrollzellen der Bauchspeicheldrüse (hTERT-HPNE) eine ähnliche CAP1-Expression aufweisen. Die CAP2-Blot-Ergebnisse zeigen, dass die Krebszellen PANC-1 und Mia PaCa-2 reichlich CAP2 exprimieren, das deutlich höher als in den hTERT-HPNE-Kontrollzellen war. (B) Der Western Blot zeigt eine erhöhte S308/S310-Phosphorylierung von CAP1 in den PANC-1- und CFPAC-1-Pankreaskrebszellen im Vergleich zu den nicht transformierten hTERT-HPNE-Pankreaszellen. Der phosphorspezifische Antikörper erkennt die Phosphorsignale an beiden Resten. Die ausgerichteten Sequenzen oben zeigen die Sequenzen, die die Tandem-Phosphor-Regulationsstelle umgeben. Die Serinreste (S307 & S309 bei CAP1 der Maus; S308 & S310 bei CAP1 des Menschen) in der Tandemstelle sind fett und kursiv (auch unterstrichen) hervorgehoben. Die Phosphorsignale wurden mit Hilfe der Densitometrie quantifiziert, und die Ergebnisse von drei Experimenten wurden mit dem Student’s t-Test analysiert und in der Grafik dargestellt, wobei die Fehlerbalken den S.E.M. darstellen. „*“ bedeutet P < 0,05 und „**“ bedeutet P < 0,01. (C) Die Behandlung der Zellen mit dem GSK3-Inhibitor 6-BIO für 16 Stunden verringerte die CAP1-Phosphorylierung sowohl in PANC-1-Pankreaskrebszellen als auch in hTERT-HPNE-Zellen in einer dosisabhängigen Weise deutlich. 6-BIO verringerte auch die CAP1-Phosphorylierung in CFPAC-1-Zellen in ähnlicher Weise (nicht gezeigt). GAPDH dient als Ladekontrolle beim Western Blotting.
Wir haben bereits berichtet, dass GSK3 S309 an CAP124 der Maus phosphoryliert (entspricht S310 an menschlichem CAP1; die übereinstimmenden Sequenzen sind in Abb. 1B dargestellt). Angesichts der berichteten Hyperaktivierung von GSK3 bei Bauchspeicheldrüsenkrebs25 untersuchten wir eine mögliche Erhöhung der S308/S310-Phosphorylierung auf CAP1 in Krebszellen, indem wir einen phosphorspezifischen Antikörper verwendeten, der beim Western Blotting Phosphorsignale an beiden Serinresten erkennt24. Interessanterweise war die S308/310-Phosphorylierung in den Krebszellen im Vergleich zu den Kontrollzellen deutlich erhöht (Abb. 1B, mit quantifizierten Daten nur für die Zelllinien PANC-1 und CFPAC-1, aber ähnliche Ergebnisse wurden auch mit AsPC-1- und Mia PaCa-2-Zellen erzielt). Als Nächstes hemmten wir GSK3, indem wir die Krebszellen mit dem starken GSK3-Inhibitor 6-BIO (6-Bromindirubin-3′-oxim)31 behandelten, und stellten fest, dass die Behandlung die S308/S310-Phosphorylierung von CAP1 in PANC-1- und CFPAC-1-Zellen dosisabhängig reduzierte (Abb. 1C, nur für PANC-1-Zellen). Die Behandlung mit 6-BIO verringerte auch die CAP1-Phosphorylierung in den Kontrollzellen des Pankreas. Dementsprechend reduzierte ein selektiverer GSK3-Inhibitor, LiCl32, auch die CAP1-Phosphorylierung in PANC-1- und AsPC-1-Zellen, wie später gezeigt wird. Diese Ergebnisse belegen, dass GSK3 auch Teil der Phosphorylierungsmaschinerie für CAP1 an S308/S310 in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen ist. Es wird auch darauf hingewiesen, dass die Behandlung von Krebszellen und Kontrollzellen mit 6-BIO über einen unbekannten Mechanismus zu einer deutlichen Hochregulierung von CAP1 führte.
Die Ausschaltung von CAP1 führte zu verstärkten Stressfasern sowie zu einer verringerten Motilität und Invasion von Krebszellen
Als nächstes versuchten wir, CAP1 zum Schweigen zu bringen, um die Rolle von CAP1 in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu bestimmen. Das stabile Knockdown-Paradigma, das wir zuvor entwickelt hatten, ist mit einer Rettungsstrategie kompatibel, die es ermöglicht, die Spezifität der aus der Deletion von CAP abgeleiteten Phänotypen zu überprüfen112,18,24. Mit Hilfe von zwei shRNA-Konstrukten S2 und S3, die auf unabhängige Nukleotidsequenzen abzielen und CAP1 in HeLa- und Brustkrebszellen effektiv zum Schweigen bringen12,18,24,33, konnten wir stabile Klone mit effizientem CAP1-Knockdown in PANC-1- und AsPC-1-Zellen erzeugen, was durch Western Blotting bestätigt wurde (Abb. 2A). Jeweils zwei stabile Knockdown-Klone, die von PANC-1 (S2-1 und S3-3) und AsPC-1 (S2-3 und S2-7) abstammen, wurden durch Neomycin-Selektion hergestellt. Die Versuche, CAP1 in den Krebszelllinien CFPAC-1 und Mia PaCa-2 zum Schweigen zu bringen, blieben jedoch erfolglos. Die CFPAC-1-Zellen bildeten nach der Antibiotikaselektion keine Kolonien, während keine der etwa zwei Dutzend untersuchten stabilen Kolonien eine wesentliche Reduzierung der CAP1-Expression in Mia-PaCa-2-Zellen aufwies (Daten nicht gezeigt).
Die Ausschaltung von CAP1 in Krebszellen führte zu verstärkten Aktin-Stressfasern und reduzierter Zellmotilität und Invasion. (A) Effizienter CAP1-Knockdown in jeweils zwei stabilen Klonen für PANC-1- und AsPC-1-Zellen, bestätigt durch Western Blotting. CAP1 wurde im Western Blotting nachgewiesen, wobei GAPDH als Ladekontrolle verwendet wurde. (B) Die Depletion von CAP1 in PANC-1-Zellen führte zu einer verstärkten Bildung von Aktinstressfasern. In Kontrollzellen, die den leeren Vektor für die shRNA (Vec) enthalten, gab es nur sehr wenige Aktinstressfasern (mit Pfeilen gekennzeichnet). Im Gegensatz dazu waren in den CAP1-Knockdown-Zellen (S2-1 und S3-3) die Aktinstressfasern verstärkt (mit Pfeilen gekennzeichnet), wie in der Fluoreszenzmikroskopie nach Phalloidin-Färbung beobachtet wurde. (C) Die Depletion von CAP1 reduzierte die Motilität sowohl von PANC-1- als auch von AsPC-1-Zellen, wie in den Wundheilungs- und Transwell-Migrationsassays (nur für PANC-1) festgestellt wurde. Für die Transwell-Migrationsuntersuchungen wurden ~2 × 104 Zellen, die über Nacht in Serumstarre versetzt wurden, auf jeden Einsatz geladen, der sich in einer mit serumhaltigem Medium gefüllten Vertiefung befand. Nach 16 Stunden wurden die migrierten Zellen ausgewertet, und die Daten von drei unabhängigen Experimenten wurden gesammelt, mit dem Student’s t-Test analysiert und in der Grafik dargestellt, wobei die Fehlerbalken S.E.M. darstellen. „*“ bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu den Kontrollzellen, die einen leeren Vektor (Vec) enthalten. (D) Die Depletion von CAP1 reduzierte die Matrigel-Invasion in PANC-1-Zellen. Die Assays sowie die Datenerfassung und -analyse wurden ähnlich wie bei den Transwell-Migrationsassays durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Insertionsmembranen mit Matrigel vorbeschichtet wurden. „*“ bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu den Kontrollzellen. (E) Reduzierte EMT in den CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen, wie durch erhöhte E-Cadherin-Expression sowie reduzierte Vimentin-Expressionswerte in den stabilen CAP1-Knockdown-Klonen angezeigt. GAPDH dient als Ladekontrolle in Western Blots.
Wir untersuchten zunächst morphologische und Aktin-Zytoskelett-Veränderungen in den CAP1-knockdown PANC-1 und AsPC-1 Zellen. Im Gegensatz zu den vergrößerten Zellen in den CAP1-Knockdown-Zellen von HeLa und metastasierenden Brustkrebszellen12,18,24 führte die Depletion von CAP1 nicht zu einer spürbaren Vergrößerung der PANC-1- oder AsPC-1-Zellen. Als Nächstes färbten wir das Aktin-Zytoskelett in den PANC-1-Zellen mit Phalloidin an, gefolgt von Fluoreszenzmikroskopie. PANC-1-Zellen (und Bauchspeicheldrüsenkrebszellen im Allgemeinen) scheinen schlecht organisierte Aktin-Zytoskelett-Strukturen aufzuweisen, insbesondere im Hinblick auf die Stressfasern (Abb. 2B), im Vergleich zu den Zelllinien, die üblicherweise für Aktin-Zytoskelett-Studien verwendet werden, wie HeLa- und NIH3T3-Fibroblasten12,24. Dennoch waren in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown im Vergleich zu den Kontrollzellen vermehrt Stressfasern zu beobachten (Abb. 2B). Alle 26 untersuchten Kontrollzellen, die einen leeren Vektor beherbergen, zeigten nur ein sehr geringes Vorkommen von Stressfasern. Im Gegensatz dazu wiesen 20 von 27 (74,1 %) der untersuchten S2-1- und 18 von 23 (78,3 %) der S3-3-CAP1-Knockdown-Zellen auffallend viele Stressfasern auf, ähnlich wie in Abb. 2B gezeigt. Die Anhäufung von Stressfasern wurde durchweg in anderen Zellen mit CAP1-Depletion beobachtet12,13, ein Phänotyp, von dem man annimmt, dass er aus dem Verlust beider CAP1-Funktionen bei der Sequestrierung von Aktinmonomeren und der Förderung des Aktinfilamentumsatzes resultiert.
In Übereinstimmung mit den verstärkten Stressfasern wurde berichtet, dass die Depletion von CAP1 die Motilität in einer Reihe von Säugetierzelltypen, einschließlich Krebszellen, reduziert13,14,17,18,19. Die vorübergehende Ausschaltung von CAP1 in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen führte auch zu einer Verringerung der Zellmotilität in Wundheilungstests14. Wir testeten die Auswirkung eines stabilen CAP1-Knockdowns auf die Invasivität von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, indem wir Wundheilungstests, Transwell-Migrationstests und Matrigel-Invasionstests durchführten. Die Ausschaltung von CAP1 reduzierte die Zellmotilität in den Wundheilungstests sowohl für PANC-1- als auch für AsPC-1-Zellen erheblich (Abb. 2C), was mit den zuvor berichteten Ergebnissen übereinstimmt14. Die Wunden in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown (sowohl S3-3 als auch S2-1) heilten 24 Stunden nach der Einführung nur geringfügig, während sich der Spalt in den Kontrollzellen fast vollständig gefüllt hatte. Ähnliche Effekte wurden bei den stabilen CAP1-knockdown AsPC-1-Klonen S2-3 und S2-7 beobachtet (Abb. 2C). Die Ergebnisse der Transwell-Migrationsuntersuchungen von PANC-1-Zellen stimmten mit denen der Wundheilungsuntersuchungen überein, wie die Grafik der quantifizierten Ergebnisse im unteren Feld zeigt (Abb. 2C). Darüber hinaus zeigen die Invasionstests, dass die Depletion von CAP1 auch die Fähigkeit der PANC-1-Krebszellen, in Matrigel einzudringen und zu invadieren, reduziert (Abb. 2D). Student’s t-test-Analysen der Daten aus drei unabhängigen Assays zeigen eine signifikant verringerte Invasion in den stabilen PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown (Abb. 2D). Da EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition) mit der Invasivität von Krebszellen zusammenhängt, testeten wir schließlich die potenzielle Auswirkung des CAP1-Knockdowns auf EMT. Tatsächlich war in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown E-Cadherin hochreguliert, was auf eine verringerte EMT hinweist (Abb. 2E). Wir testeten auch einen anderen EMT-Marker, Vimentin, und stellten fest, dass die Deletion von CAP1 seine Expression reduzierte (Abb. 2E). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse, dass CAP1 eine wichtige Rolle bei der Invasivität und EMT in PANC-1-Krebszellen spielt.
Die Hemmung von GSK3, die die CAP1-Phosphorylierung unterdrückt, reduzierte die Motilität und Invasion von Krebszellen
Unsere früheren Ergebnisse deuten darauf hin, dass die vorübergehende Phosphorylierung für die Funktion von CAP1 bei der Regulierung des Aktin-Zytoskeletts entscheidend ist24. Die erhöhte CAP1-Phosphorylierung in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen, die mit der aktivierten GSK3 übereinstimmt, legt nahe, dass die Phosphorregulierung auch eine Rolle für die CAP1-Funktion bei der Invasivität von Krebszellen spielen könnte. Wir testeten diese Möglichkeit durch Hemmung von GSK3, das die S308/S310-Phosphorylierung unterdrückt und in der Zwischenzeit die CAP1-Regulierung durch vorübergehende Phosphorylierung an der regulatorischen Stelle unterbricht. PANC-1-Zellen wurden mit 6-BIO behandelt und anschließend mit Zellmigrations- und Invasionstests untersucht. Die Auswirkungen der reduzierten S308/S310-Phosphorylierung auf CAP1 durch die Behandlung mit 5 μM 6-BIO (Abb. 1C) wurden zuerst getestet. Wie in Abb. 3A gezeigt, verringerte die Behandlung mit 6-BIO die Motilität von PANC-1-Zellen sowohl im Wundheilungs- als auch im Transwell-Migrationsassay erheblich. Wir bestätigten auch, dass die Behandlung von PANC-1- und AsPC-1-Zellen mit einem anderen GSK3-Inhibitor, LiCl, die CAP1-Phosphorylierung sowie die Zellmotilität in Wundheilungstests reduzierte (Abb. 3A,B). Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit 6-BIO auch die Matrigel-Invasion von PANC-1-Zellen (Abb. 3C). Da bekannt ist, dass GSK3 über eine Vielzahl von Substratmolekülen eine Vielzahl von Zellfunktionen reguliert, ist es wahrscheinlich, dass die Wirkung der GSK3-Hemmung auf die Zellmotilität ein kollektiver Output über mehrere GSK3-Targets ist, die an der Regulierung des Zytoskeletts, der Zellpolarisation und der Migration beteiligt sind34,35. Wir testeten und verglichen daher die Auswirkungen von 6-BIO auf die Verringerung der Zellmotilität in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown und in den Kontrollzellen. Wie die Grafik in Abb. 3D zeigt, verringerte die Behandlung mit 6-BIO die Motilität der Kontrollzellen (Vec) signifikant, nicht aber die der CAP1-Knockdown-Zellen (S2-1 und S3-3) in den Wundheilungstests. Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse, dass die Phosphorregulierung durch S308/S310 eine wichtige Rolle für CAP1 bei der Förderung der Motilität und Invasion in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen spielt.
Die Hemmung von GSK3, die die CAP1-Phosphorylierung reduzierte, beeinträchtigte ebenfalls die Motilität und Invasion von Krebszellen. (A) Die Behandlung von PANC-1-Zellen mit 6-BIO oder LiCl verringerte die Zellmotilität in den Wundheilungs- und Transwell-Migrationsassays. Die Behandlung mit 100 mM LiCl reduzierte die CAP1-Phosphorylierung in PANC-1-Zellen ebenfalls wirksam. Transwell-Migrationsassays mit PANC-1-Zellen wurden ähnlich wie in Abb. 2 beschrieben durchgeführt, wobei NT für Zellen ohne 6-BIO-Behandlung steht. (B) Die Behandlung mit 100 mM LiCl verringerte die CAP1-Phosphorylierung in PANC-1-Zellen sowie die Zellmotilität in den Wundheilungstests ebenfalls deutlich. (C) Die Behandlung von PANC-1-Zellen mit 5 μM 6-BIO reduzierte die Invasion der Krebszellen in Matrigel-Invasionstests deutlich. Matrigel-Invasionstests, einschließlich Datenerfassung und -analyse, wurden ähnlich wie in Abb. 2D beschrieben durchgeführt. (D) Der Knockdown von CAP1 in PANC-1-Zellen beeinträchtigte die Wirkung von 6-BIO bei der Verringerung der Zellmotilität in Wundheilungstests. Die stabilen PANC-1-Klone der Kontrolle und des CAP1-Knockdowns wurden 16 Stunden lang nach dem Einbringen der Wunde kultiviert, und die gestrichelten Linien zeigen die Ränder der ursprünglichen Lücke an. Die Zellmotilität wurde quantifiziert, mit dem Student’s t-Test analysiert und in der Grafik dargestellt, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. „*“ bedeutet P < 0,05 und „**“ bedeutet P < 0,01.
Phosphormutanten von CAP1 hatten beeinträchtigte Funktionen bei der Abschwächung der verstärkten Stressfasern und der Förderung der Entwicklung von Lamellipodien in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown
Unsere Ergebnisse aus den CAP1-Knockdown-Zellen unterstützen, dass CAP1 für die Motilität und Invasion von Krebszellen erforderlich ist, und die Ergebnisse der GSK3-Inhibition deuten darauf hin, dass die S308/S310-Phosphorylierung eine Schlüsselrolle bei den CAP1-Funktionen spielt. Als Nächstes haben wir eine Reexpressionsstrategie angewandt, um diese Fälle weiter zu untersuchen. Wildtyp-CAP1 (WTCAP1) und die Phosphormutanten, die entweder phosphorylierte (S307D/S309D; DD) oder nicht phosphorylierbare (S307A/S309A; AA) Formen von CAP1 nachahmen, wie zuvor beschrieben12,18,24, wurden in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown stabil reexprimiert, um ihre Fähigkeiten zur Rettung des Aktinzytoskeletts und der zellmorphologischen Phänotypen zu testen. Diese Mutanten weisen Fehlpaarungen mit der S3 shRNA-Zielsequenz auf, um die Erkennung der abgeleiteten mRNAs durch die in den Knockdown-Zellen stabil vorhandene shRNA zu verhindern, ohne jedoch eine Aminosäure auf CAP112 zu verändern. Wir waren in der Lage, stabile Klone zu etablieren, die WT-Maus-CAP1 oder die AA- und DD-Phosphormutante reexprimieren, wie ein Western-Blotting gegen den 6xHis-Tag bestätigt (Abb. 4A). Beachten Sie, dass zwei irrelevante Spuren aus dem ursprünglichen Western-Blot-Bild entfernt wurden (die Proben in diesen beiden Spuren wurden verwendet, um die Reexpression von zwei Serin-36-Phosphormutanten am N-Terminus zu bestätigen). Der gesamte Satz der ursprünglichen Western-Blot-Ergebnisse ist in der ergänzenden Abb. 1 dargestellt. Die Morphologie der Zellen, die entweder die AA- (AA-R) oder die DD-Mutante (DD-R) reexprimieren, wurde mit Hilfe der Phasenmikroskopie untersucht und mit der Morphologie der Zellen verglichen, die WTCAP1 (WT-R) reexprimieren. Es wurde berichtet, dass der Knockdown von CAP1 in einigen Säugetierzelltypen, darunter HeLa- und metastatische Brustkrebszellen, zu einer signifikanten Vergrößerung der Zellen führt12,13,18, ein Phänotyp, den wir zuvor als spezifisch für den Knockdown von CAP bestätigt haben112,18. Der Knockdown von CAP1 in PANC-1-Zellen oder AsPC-1-Zellen zeigte diese Wirkung jedoch nicht. Vielmehr führte die stabile Reexpression von WTCAP1 oder der Phosphormutanten in den Knockdown-Zellen zu einer deutlichen Vergrößerung der Zellen (Abb. 4B). Darüber hinaus führte die Reexpression von WTCAP1 zur Entwicklung von Lamellipodien in robuster Größe (mit Pfeilen gekennzeichnet), einer subzellulären Struktur, die reich an filamentösem Aktin ist und für die gerichtete Zellbewegung entscheidend ist (Abb. 4C), während praktisch keine der Knockdown-Zellen, die einen leeren Kontrollvektor enthielten, solche Lamellipodien entwickelten. Auch die reexprimierte AA- oder DD-Mutante stimulierte die Bildung von Lamellipodien bis zu einem gewissen Grad, aber ihre Größe war deutlich geringer als die der Zellen, die WTCAP1 reexprimierten (siehe Pfeile in Abb. 4C). Wir haben für jeden Zelltyp 200 Zellen gezählt, und die Prozentsätze der Zellen, die große Lamellipodien aufweisen, waren: 0% (0/200) für die Knockdown-Zellen (Vec), 14,5% (29/200) für die WT-R-Zellen und 9% (18/200) bzw. 7,5% (15/200) für die AA-R- und DD-R-Zellen.
Auswirkungen der Reexpression von WTCAP1 und der Phosphormutanten in den CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen auf das Aktinzytoskelett, die Zellgröße und die Lamellipodienentwicklung. (A) Bestätigung der Re-Expression von WTCAP1 und den AA- und DD-Phosphormutanten in den stabilen S3-3 CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen im Western Blotting mit dem Antikörper gegen den 6xHis-Tag. Zwei irrelevante Spuren wurden aus dem ursprünglichen Western-Blot-Bild entfernt (siehe ergänzende Abb. 1); (B) quantifizierte Daten, die eine signifikant erhöhte Zellgröße in Zellen zeigen, die WTCAP1 oder die Phosphormutanten in den CAP1-Knockdown-Zellen reexprimieren. Die Größe von 50 Zellen pro Feld wurde mit dem Programm Image-J gemessen. Die Daten wurden mit dem Student’s t-Test analysiert und in der Grafik dargestellt, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung angeben. „*“ bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu den Kontrollzellen, die den leeren Vektor (Vec-R) tragen. (C) Phasenbilder zeigen, dass die Re-Expression von WTCAP1 oder der Phosphormutanten die Bildung von Lamellipodien stimuliert. Einige der Zellen, die WTCAP1 reexprimierten (WT-R), entwickelten extrem große Lamellipodien (mit Pfeilen gekennzeichnet). Die erneute Expression der AA- (AA-R) oder DD-Mutante (DD-R) simulierte ebenfalls die Bildung von Lamellipodien, aber ihre Größe ist deutlich geringer als die der Zellen, die WTCAP1 erneut exprimieren. In den CAP1-Knockdown-Kontrollzellen, die den leeren Vektor (Vec-R) enthielten, wurden keine solchen Lamellipodien beobachtet. (D) Die Re-Expression von WTCAP1 in den CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen reduzierte die Stressfasern, während die Zellen, die die Mutanten reexprimierten, verstärkte Stressfasern aufwiesen. Die Zellen, die die phosphormimetische DD-Mutante reexprimierten, hatten die stärksten Stressfasern. Die Pfeile zeigen die Stressfasern bzw. deren Fehlen im Fall der WT-R-Zellen an.
Als Nächstes untersuchten wir die Fähigkeit der Phosphormutanten, die verstärkten Stressfasern in den CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen zu verringern. Wie in den konfokalen Bildern in Abb. 4D zu sehen ist, linderte die Reexpression von WTCAP1 (WT-R) die verstärkten Stressfasern effektiv und rettete so den Phänotyp, und die Stressfasern lösten sich in großen, mit einem Pfeil gekennzeichneten Bereichen auf. Im Gegensatz dazu waren die Phosphormutanten weniger wirksam bei der Linderung der verstärkten Stressfasern. Zellen, die die AA-Mutante reexprimierten, hatten geringfügig mehr Stressfasern als die durch WTCAP1 geretteten Zellen, während die Zellen, die die DD-Mutante reexprimierten, sogar noch mehr Stressfasern aufwiesen. Diese Ergebnisse stimmen mit unseren früheren Erkenntnissen aus HeLa-Zellen überein, die darauf hindeuten, dass dephosphoryliertes CAP1 im Vergleich zu phosphoryliertem CAP124 die „aktive“ Form ist, während eine vorübergehende Phosphorylierung für optimale zelluläre Funktionen von CAP1 erforderlich sein dürfte. Diese Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass die transiente S308/S310-Phosphorylierung für CAP1 wichtig ist, um das Aktin-Zytoskelett in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen zu regulieren; eine Störung der Regulierung durch transiente Phosphorylierung führt zu Defekten in der CAP1-Funktion bei der Förderung des Aktinfilament-Umsatzes.
CAP1-Phosphormutanten hatten Defekte, die die reduzierte Invasivität in den CAP1-Knockdown-Krebszellen wiederherstellten
Da der dynamische Aktinfilamentumsatz die primäre treibende Kraft der Zellbewegung ist, haben wir als nächstes getestet, wie gut die Phosphormutanten die reduzierte Zellmotilität und Invasion in den CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen wiederherstellen. Zunächst führten wir Transwell-Migrationsassays durch und stellten fest, dass die Reexpression von WTCAP1 die Zellmotilität im Vergleich zu den Kontrollzellen, die einen leeren Vektor beherbergen, signifikant erhöhte, wie die quantifizierten Ergebnisse in der Grafik zeigen (Abb. 5A). Die reexprimierte AA-Mutante (AA-R) war zwar nicht so wirksam wie WTCAP1, konnte aber die reduzierte Zellmotilität in den Transwell-Migrationsassays teilweise wiederherstellen. Im Gegensatz dazu konnte die DD-Mutante (DD-R) die reduzierte Zellmotilität nicht retten, und die Rate war vergleichbar mit der in den CAP1-Knockdown-Zellen, die einen leeren Vektor enthielten. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit den Möglichkeiten zur Rettung der erhöhten Stressfasern durch WTCAP1 und die Phosphormutanten. Des Weiteren testeten wir die Rettung der reduzierten Matrigel-Invasion in den CAP1-Knockdown-Zellen, wie die quantifizierten Ergebnisse in Abb. 5B zeigen. In ähnlicher Weise rettete WTCAP1 die reduzierte Invasion in den CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen am effektivsten; die AA-Mutante erreichte eine teilweise Rettung, während die DD-Mutante den Phänotyp buchstäblich nicht retten konnte. Schließlich reduzierte die Re-Expression von WTCAP1 in den CAP1-Knockdown-Zellen auch die E-Cadherin-Expression (Abb. 5C), was ein weiterer Beleg dafür ist, dass CAP1 für die EMT in PANC-1-Krebszellen erforderlich ist. Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse, dass die Phosphorregulation über die S308/S310-Tandemstelle eine wichtige Rolle für CAP1 bei der Förderung der Motilität und Invasion von Pankreaskrebszellen spielt.
Effekte von WTCAP1 und den Phosphormutanten bei der Wiederherstellung der reduzierten Motilität und Invasion in den CAP1-Knockdown PANC-1-Zellen. (A) WTCAP1 und die AA-Mutante retteten die reduzierte Motilität der CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen in Transwell-Migrationsassays effektiv, während die DD-Mutante dabei versagte. Die Experimente, die Datenerfassung und die Analysen wurden in ähnlicher Weise durchgeführt wie in Abb. 2 beschrieben. Die Fehlerbalken stellen S.E.M. dar, und „*“ bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu den Kontrollzellen, die einen leeren Vektor (Vec-R) enthalten. (B) WTCAP1 und die AA-Mutante retteten die reduzierte Matrigel-Invasion der PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown effektiv, während die DD-Mutante dies ebenfalls nicht tat. Die Experimente, die Datenerfassung und die Analysen wurden in ähnlicher Weise durchgeführt wie in Abb. 2 beschrieben. Die Fehlerbalken stellen S.E.M. dar, und „*“ bedeutet P < 0,05 im Vergleich zu den Kontrollzellen. (C) Die Re-Expression von WTCAP1 rettete auch das hochregulierte E-Cadherin in den PANC-1-Zellen mit CAP1-Knockdown.
Beweise, die belegen, dass CAP1 extrazelluläre Wachstumsfaktorsignale vermittelt, um die Invasivität von Krebszellen zu kontrollieren
Physiologische Stimuli, wie die Wachstumsfaktoren PDGF und HGF (Hepatozyten-Wachstumsfaktor)36, sind dafür bekannt, dass sie die Umlagerung des Aktinzytoskeletts und die Zellmigration stimulieren. Da die Phosphorregulierung an S308/S310 entscheidend für die Funktion von CAP1 bei der Regulierung des Aktinzytoskeletts und der Invasivität von Krebszellen ist, haben wir die Möglichkeit untersucht, dass diese Stimuli die CAP1-Phosphorylierung regulieren und dadurch die Umlagerung des Aktinzytoskeletts und die Invasivität von Krebszellen steuern können. Interessanterweise führte die Behandlung von PANC-1- und AsPC-1-Zellen unter Serummangel mit PDGF zu einer Verringerung der S308/S310-Phosphorylierung von CAP1, vor allem zum 5-Minuten-Zeitpunkt (Abb. 6A und B). Die Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen mit HGF oder Serum hatte keinen nennenswerten Effekt auf die Dephosphorylierung von CAP1 (ergänzende Abb. 2; dargestellt für PANC-1-Zellen). Daher ist die Signalübertragung durch CAP1 wahrscheinlich zumindest teilweise dafür verantwortlich, dass PDGF die Reorganisation des Aktinzytoskeletts und die Invasivität der Krebszellen stimuliert. Diese Ergebnisse stimmen auch mit der Vorstellung überein, dass das dephosphorylierte CAP1 die „aktive“ Form ist, wie es mehrere Beweise nahelegen, darunter die Cofilin-Bindung, die subzelluläre Lokalisierung der Phosphormutanten und die erhöhte Phosphorylierung von CAP1 in Zellen, die in Suspension gezüchtet werden24. Es wird jedoch angenommen, dass die vorübergehende Phosphorylierung an der Tandem-Regulationsstelle, d. h. der Wechsel zwischen der phosphorylierten und der dephosphorylierten Form, für die optimalen zellulären Funktionen von CAP124 erforderlich ist. Die CAP1-Deposphorylierungssignale wirken wahrscheinlich zusammen mit den CAP1-Phosphorylierungssignalen, um die CAP1-Zellfunktionen durch die vorübergehende Phosphorylierung an S308/S310 zu regulieren.
PDGF-induzierte Dephosphorylierung von CAP1 in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. (A) Die Behandlung von serumarmen AsPC-1-Krebszellen mit PDGF induzierte die Dephosphorylierung von CAP1 an S308/S310. Die Zellen wurden über Nacht kultiviert, dann 24 Stunden lang unter Serummangel gehalten und anschließend für die angegebenen Zeiträume mit 30 ng/ml PDGF behandelt. Die Zelllysate wurden aufbereitet und im Western Blotting mit einem phosphorspezifischen Antikörper verwendet, der Phosphorsignale an beiden Resten der Tandem-Regulationsstelle von CAP1 nachweist. Der Dephosphorylierungseffekt war am signifikantesten zum 5-Minuten-Zeitpunkt der PDGF-Behandlung. (B) Die Behandlung von serumarmen PANC-1-Zellen mit PDGF führte ebenfalls zu einer bemerkenswerten Dephosphorylierung von CAP1, ähnlich wie bei AsPC-1-Zellen. Die Behandlung der Zellen und das Western Blotting wurden nach denselben Verfahren wie bei den AsPC-1-Zellen durchgeführt. GAPDH diente als Ladekontrolle im Western Blot.
Depletion von CAP1 in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen verringerte die FAK-Aktivität, verursachte aber keine Veränderungen bei ERK oder der Zellproliferation
Wir haben kürzlich eine neue Rolle für CAP1 bei der Regulierung der Proliferation von Brustkrebszellen identifiziert, bei der die Depletion von CAP1 zellkontextabhängige Auswirkungen auf die Proliferation hat, begleitet von konsistenten Veränderungen der ERK-Aktivität18. Wir haben getestet, ob CAP1 auch ERK und die Proliferation in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen regulieren kann. In den stabilen PANC-1-Klonen mit CAP1-Knockdown wurden keine signifikanten Veränderungen in der Expression oder Phosphorylierung von ERK im Vergleich zu den Kontrollzellen festgestellt (ergänzende Abb. 3A). Wir führten auch MTT-Tests durch, um die Proliferation der stabilen S2-1- und S3-3-Knockdown-Zellen zu testen und sie mit den Kontrollzellen (Vec) zu vergleichen, und stellten leicht verringerte Zellproliferationsraten in den Knockdown-Zellen fest (ergänzende Abb. 3B). Die Unterschiede waren jedoch statisch unbedeutend, wobei die P-Werte beim Vergleich der OD (bei 570 nm) zwischen S2-1-Zellen und Kontrollzellen bei 0,219 und zwischen S3-3-Zellen und Kontrollzellen bei 0,223 lagen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CAP1 keine signifikante Rolle bei der Regulierung der Proliferation von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen spielt. Angesichts der allgemeinen Tendenz, dass stabile Knockdown-Paradigmen anfällig für Klonvariationen sind, haben wir außerdem Pools von stabilen CAP1-Knockdown-PANC-1-Zellen generiert, von denen wir annehmen, dass sie die Auswirkungen der CAP1-Depletion auf ERK genauer widerspiegeln, indem sie den potenziellen Einfluss von Selektionsverzerrungen vermeiden. Wie in Abb. 7A gezeigt, wurden nach der Neomycin-Selektion Pools von stabilen PANC-1-Zellen mit effizientem CAP1-Knockdown gebildet, die sowohl von den S2 als auch von den S3 shRNA-Konstrukten stammten, wie im Western Blotting bestätigt wurde. In Übereinstimmung mit den Erkenntnissen aus der Verwendung stabiler Knockdown-Klone wurden in den Knockdown-Pool-Zellen im Vergleich zu den Kontroll-Pool-Zellen keine bemerkenswerten Veränderungen der ERK-Expression oder ihrer Phosphorylierung festgestellt.
CAP1-Knockdown-PANC-1-Pool-Zellen wiesen eine verringerte FAK-Aktivität und Zelladhäsion auf, aber keine Veränderungen bei ERK. (A) PANC-1-Poolzellen mit CAP1-Knockdown, die sowohl von S2 als auch von S3 shRNA-Konstrukten stammen, wiesen im Vergleich zu den Kontroll-Poolzellen mit leerem Vektor keine veränderte ERK-Expression oder -Aktivität auf, wie im Western Blotting nachgewiesen wurde. Die ERK-Aktivität wurde im Western Blotting mit einem phosphorspezifischen Antikörper gegen die Thr202/Tyr204-Stellen nachgewiesen. GAPDH diente als Ladekontrolle. (B) In den PANC-1-Pool-Zellen mit CAP1-Knockdown wurde im Vergleich zu den Kontroll-Pool-Zellen eine verringerte FAK-Aktivität festgestellt. Die FAK-Aktivität wurde anhand der Phosphorylierung an Tyr397 unter Verwendung eines phosphorspezifischen Antikörpers gegen diese Stelle im Western Blotting bestimmt; (C) CAP1-Knockdown-Poolzellen wiesen zu den getesteten Zeitpunkten (45 Minuten und 2 Stunden) nach dem Ausplattieren der Zellen auf Fibronektin-beschichtete Platten eine verringerte Zelladhäsion auf. Ungefähr 2 × 104 Zellen wurden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte plattiert, und Zellen, die zu den angegebenen Zeitpunkten nicht angeheftet waren, wurden abgewaschen. Die Anzahl der angehefteten Zellen wurde in fünf zufälligen Feldern unter einem Phasenmikroskop gezählt und Bilder aufgenommen. (D) Die Daten von drei unabhängigen Zelladhäsionstests wurden mit dem Student’s t-Test analysiert und in das Diagramm eingezeichnet, wobei die Fehlerbalken die Standardabweichung darstellen. „**“ bedeutet P < 0,01 im Vergleich zu den Kontrollzellen, die den leeren Vektor enthielten.
Die Ausschaltung von CAP1 in Brustkrebszellen verursachte deutliche Veränderungen von FAK in metastatischen und nicht-metastatischen Brustkrebszellen18. Wir konnten auch eine verringerte FAK-Aktivität in den PANC-1-Poolkrebszellen mit CAP1-Knockdown nachweisen, ohne dass sich die FAK-Expressionswerte veränderten (Abb. 7B). Auf der Grundlage dieser Ergebnisse testeten wir die Auswirkungen der CAP1-Depletion auf die Zelladhäsion in Adhäsionstests, ähnlich wie wir es zuvor getan hatten12,18. Wir stellten fest, dass die von beiden shRNA-Konstrukten stammenden CAP1-Knockdown-Poolzellen im Vergleich zu den Kontrollzellen eine deutlich verringerte Zelladhäsion aufwiesen (Abb. 7C). Zu beiden Zeitpunkten (45 Minuten und 2 Stunden), nachdem die Zellen auf eine mit Fibronektin beschichtete Oberfläche plattiert worden waren, hafteten deutlich mehr Kontrollzellen als die CAP1-Knockdown-Poolzellen. Außerdem hatten sich mehr der angehefteten Kontrollzellen vollständig ausgebreitet (Lamellipodien entwickelt und die Zellen sind nicht so hell) als die CAP1-Knockdown-Zellen (Abb. 7C). Wir haben die Anzahl der angehefteten Zellen aus drei Feldern zum Vergleich ausgewertet, und die Daten aus drei unabhängigen Experimenten wurden quantifiziert, wie in der Grafik dargestellt (Abb. 7D).