4.3. Struktur des Nikotinrezeptors
Der Nikotinrezeptor des elektrischen Organs und des Skelettmuskels der Wirbeltiere ist ein Pentamer, das aus vier verschiedenen Untereinheiten (a, b, g und d) im stöchiometrischen Verhältnis von 2:1:1:1 besteht. In reifen, innervierten Muskelendplatten wird die Untereinheit g durch e, eine eng verwandte Untereinheit, ersetzt. Die einzelnen Untereinheiten sind in ihrer Aminosäuresequenz zu etwa 40 % identisch und stammen von einem gemeinsamen Urgen ab. Der Nikotinrezeptor wurde zum Prototyp für andere pentamere ligandengesteuerte Ionenkanäle, zu denen auch die Rezeptoren für die hemmenden Aminosäuren (g-Aminobuttersäure und Glycin) und bestimmte Serotoninrezeptoren (5-HT3) gehören. Jede der Untereinheiten des pentameren Rezeptors hat eine Molekularmasse von 40 000 bis 60 000 Dalton. Die aminoterminalen 210 Reste bilden praktisch die gesamte extrazelluläre Domäne. Daran schließen sich vier transmembranüberspannende (TM) Domänen an; der Bereich zwischen der dritten und vierten Domäne bildet den größten Teil der zytoplasmatischen Komponente. Jede der Untereinheiten des nikotinischen ACh-Rezeptors hat eine extrazelluläre und eine intrazelluläre Exposition an der postsynaptischen Membran. Die fünf Untereinheiten sind um eine Pseudo-Symmetrieachse angeordnet, die einen intern gelegenen Kanal umschreibt.
Der Rezeptor ist ein asymmetrisches Molekül (14 nm×8 nm) von 250 000 Dalton, wobei sich der Großteil der nicht-membranüberspannenden Domäne auf der extrazellulären Oberfläche befindet. In Verbindungsbereichen (d.h. der motorischen Endplatte des Skelettmuskels und der ventralen Oberfläche des elektrischen Organs) ist der Rezeptor in hoher Dichte (10 000/mm2) in einer regelmäßigen Packungsanordnung vorhanden. Diese Anordnung der Rezeptoren ermöglichte die elektronenmikroskopische Bildrekonstruktion ihrer molekularen Struktur. Ein ACh-bindendes Protein, das nur mit der extrazellulären Domäne des Nikotinrezeptors homolog ist, wurde in Süß- und Salzwasserschnecken identifiziert und strukturell und pharmakologisch charakterisiert.
Dieses Protein setzt sich als homomeres Pentamer zusammen und bindet Nikotinrezeptor-Liganden mit der erwarteten Selektivität; seine Kristallstruktur zeigt eine für den Nikotinrezeptor erwartete atomare Organisation. Die Kristallstruktur zeigt eine atomare Organisation, wie sie vom Nikotinrezeptor erwartet wird. Darüber hinaus ergibt die Fusion des ACh-Bindungsproteins mit den Transmembranabschnitten des Rezeptors ein funktionelles Protein, das die für den Rezeptor erwarteten Kanalübergänge und Zustandsänderungen aufweist. Dieses Bindungsprotein dient sowohl als strukturelles als auch als funktionelles Surrogat des Rezeptors und hat ein detailliertes Verständnis der Determinanten der Ligandenspezifität des Nikotinrezeptors ermöglicht. Die Agonisten-Bindungsstellen befinden sich an den Schnittstellen der Untereinheiten, aber im Muskel haben sich nur zwei der fünf Schnittstellen der Untereinheiten, a g und a d, zur Bindung von Liganden entwickelt. Die Bindung von Agonisten, reversiblen kompetitiven Antagonisten und dem Elapid a-Toxin schließt sich gegenseitig aus und erfordert überlappende Oberflächen auf dem Rezeptor. Beide Untereinheiten, die die Untereinheitsschnittstelle bilden, tragen zur Ligandenspezifität bei. Messungen der Membranleitwerte zeigen, dass die Ionentranslokationsraten ausreichend schnell sind (5×107 Ionen pro Sekunde), um eine Ionentranslokation durch einen offenen Kanal und nicht durch einen rotierenden Ionenträger zu erfordern. Darüber hinaus erfolgen Agonisten-vermittelte Veränderungen der Ionenpermeabilität (typischerweise eine Einwärtsbewegung von primär Na+ und sekundär Ca2+) durch einen der Rezeptorstruktur innewohnenden Kationenkanal. Der zweite Transmembranbereich auf jeder der fünf Untereinheiten bildet die innere Begrenzung des Kanals. Die Agonisten-Bindungsstelle ist eng mit einem Ionenkanal gekoppelt; im Muskelrezeptor führt die gleichzeitige Bindung zweier Agonistenmoleküle zu einer schnellen Konformationsänderung, die den Kanal öffnet. Sowohl die Bindung als auch die Gating-Reaktion zeigen eine positive Kooperativität. Einzelheiten über die Kinetik der Kanalöffnung wurden mit Hilfe elektrophysiologischer Patch-Clamp-Techniken ermittelt, die die einzelnen Öffnungs- und Schließvorgänge eines einzelnen Rezeptormoleküls unterscheiden und bestätigen, dass nikotinische Acetylcholinrezeptoren (nAChR) pentamere ligandengesteuerte Ionenkanäle sind, die sich aus Untereinheiten zusammensetzen, die aus einer extrazellulären Domäne, die die Ligandenbindungsstelle trägt, und einer separaten Ionenporen-Domäne bestehen. Die Signaltransduktion resultiert aus der allosterischen Kopplung zwischen den beiden Domänen, wobei der Abstand zwischen der Bindungsstelle und dem Tor der Porendomäne 50 Å beträgt. Studien zur Rezeptorbindung sind jedoch spezifisch für cholinerge Nikotinrezeptoren, die an isolierten Vestibularepithelien der Frösche Rana catesbiana und Rana temporaria durchgeführt wurden. Es werden Beweise für das Vorhandensein von nikotinähnlichen cholinergen Rezeptoren vorgelegt, die speziell mit den sensorischen Bereichen assoziiert sind, und die Bindung atypischer nikotinischer Agonistenkonformationen untersucht, die eine Subtyp-Selektivität verleihen, und die Schlussfolgerung gezogen, dass der nAChR eine entscheidende Rolle bei der exzitatorischen Neurotransmission spielt und ein wichtiges Ziel für Medikamente und Insektizide darstellt. Diverse nAChR-Subtypen mit verschiedenen Untereinheitskombinationen, die eine unterschiedliche Selektivität für nikotinische Medikamente verleihen, und auch eine Familie von Genen, die für Proteine kodieren, die homolog zur α-Untereinheit des muskulären nikotinischen Acetylcholinrezeptors im Rattengenom sind. Diese Gene werden im zentralen und peripheren Nervensystem in Bereichen transkribiert, von denen bekannt ist, dass sie funktionelle nikotinische Rezeptoren enthalten. Die Rolle der β2-haltigen neuronalen Nikotinrezeptoren (nAChRs) bei der Vermittlung der Nebenwirkungen von Nikotin beim Fötus und Neugeborenen. Trächtigen WT- und mutierten Mäusen, denen die β2 nAChR-Untereinheit fehlt, wurden osmotische Minipumpen implantiert, die entweder Wasser oder eine kontrollierte Nikotindosis abgaben. In der Folge kam es zu einem Vergleich der Entwicklung des sympathoadrenalen Systems und der Atem- und Erregungsreflexe der Nachkommen kurz nach der Geburt, einer Periode erhöhter Anfälligkeit gegenüber Nikotinexposition. Andererseits sind Neonicotinoide, wie Imidacloprid, nAChR-Agonisten mit starker insektizider Wirkung. Seit seiner Einführung Anfang der 1990er Jahre hat sich Imidacloprid zu einem der am häufigsten verwendeten Insektizide sowohl für den Pflanzenschutz als auch für die Tiergesundheit entwickelt. Die molekulare Grundlage der Imidacloprid-Resistenz, fünf nAChR-Untereinheiten (Nlα1-Nlα4 und Nlβ1) wurden aus Nilaparvata lugens geklont. Bei einem Vergleich der Gene der nAChR-Untereinheiten von Imidacloprid-sensiblen und Imidacloprid-resistenten Populationen wurde eine einzige Punktmutation an einer konservierten Position (Y151S) in zwei nAChR-Untereinheiten, Nlα1 und Nlα3, festgestellt. Eine starke Korrelation zwischen der Häufigkeit der Y151S-Punktmutation und dem Grad der Resistenz gegen Imidacloprid wurde durch allelspezifische PCR nachgewiesen. Durch die Expression von hybriden nAChRs, die α-Untereinheiten von Nilaparvata lugens und β2-Untereinheiten von Ratten enthalten, wurde nachgewiesen, dass die Mutation Y151S für eine erhebliche Verringerung der spezifischen Imidacloprid-Bindung verantwortlich ist. Diese Studie liefert direkte Beweise für das Auftreten einer Target-Site-Resistenz gegen ein Neonicotinoid-Insektizid und untersucht die Art der Kation-π-Bindungsstelle im nikotinischen Rezeptor und stellt fest, dass der nikotinische Acetylcholinrezeptor der Prototyp des ligandengesteuerten Ionenkanals ist. Eine Reihe von aromatischen Aminosäuren wurde als Teil der Agonisten-Bindungsstelle identifiziert, was darauf hindeutet, dass Kationen-π-Wechselwirkungen an der Bindung der quaternären Ammoniumgruppe des Agonisten Acetylcholin beteiligt sein könnten. Die Konformation cholinerger Moleküle an nikotinergen Nervenrezeptoren und eine Korrelation der Kristallstrukturanalysen der potenten nikotinergen Agonisten Acetylcholin, Acetyl-α-methylcholin, Lactoylcholin, 1,1-Dimethyl-4-phenylpiperazin und Nikotin ermöglicht die Bestimmung der Konformation cholinerger Agonisten, die für nikotinerge Nervenrezeptoren relevant sind. Die Expression von Neurotransmitterrezeptoren, die von mRNAs kodiert werden, die aus drei menschlichen Gliomzelllinien isoliert wurden. Oozyten, die mit mRNAs aus zwei Glioblastom-Zelllinien injiziert wurden, zeigten keine elektrischen Reaktionen auf die verschiedenen getesteten Neurotransmitter.
Modulation von nAChR durch Strychnin: Strychnin ist ein potenter und selektiver Antagonist an Glycinrezeptoren, der Muskel- (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ und α 1β 1δ) und neuronale (α 2β 2 und α 2β 4) nikotinische Acetylcholinrezeptoren (AcChoRs) hemmt, die in Xenopus-Oocyten exprimiert werden. Strychnin allein (bis zu 500 µmol/L) löste in Oozyten, die AcChoRs exprimieren, keine Membranströme aus, aber wenn es vor, gleichzeitig oder während der Superfusion von Acetylcholin (AcCho) angewendet wurde, hemmte es schnell und reversibel den durch AcCho ausgelösten Strom (AcCho-Strom). Die Übersetzung exogener Boten-RNA, die für nAChRs kodiert, erzeugt funktionelle Rezeptoren in Xenopus-Oozyten. In dieser Studie wurde Boten-RNA, die aus dem elektrischen Organ von Torpedo gewonnen wurde, in Xenopus-Oozyten injiziert. Dies führte zur Synthese und zum Einbau funktioneller Acetylcholinrezeptoren in die Membran der Eizelle. Wenn sie durch Acetylcholin aktiviert wurden, öffneten diese Torpedo-Acetylcholinrezeptoren in der Eizellenmembran Kanäle, deren ionische Permeabilität der von Nikotinrezeptoren in anderen Zellen ähnelte.
Die Lokalisierung von Acetylcholinrezeptoren (AChR) auf der Oberfläche der sich entwickelnden myogenen Zellen des vorderen und hinteren Latissimus dorsi-Muskels des Hühnerembryos im Zusammenhang mit dem Prozess der Innervation wurde auf ultrastruktureller Ebene unter Verwendung eines Meerrettichperoxidase-α-Bungarotoxin-Konjugats untersucht. Es wurden lokalisierte Konzentrationen von AChR in kleinen Regionen von 0,1-0.4 µm auf der Oberfläche myogener Zellen von 10 bis 14 Tage alten Muskeln gefunden. Außerdem wurden die Auswirkungen von Acetylcholin und Mitteln, die seine physiologischen Wirkungen nachahmen oder blockieren, auf die Konzentrationen von Guanosin 3′:5′-zyklisches Monophosphat (zyklisches GMP) und Adenosin 3′:5′-zyklisches Monophosphat (zyklisches AMP) in Scheiben der Großhirnrinde, des Herzventrikels und des Ileums von Säugetieren. Acetylcholin und Cholinomimetika mit vorwiegend muskarinischer Wirkung, wie Methacholin, Bethanechol und Pilocarpin, induzierten in allen drei untersuchten Geweben einen Anstieg der Konzentration von zyklischem GMP oder einen leichten Rückgang der Konzentration von zyklischem AMP.
Die funktionellen Eigenschaften und die zelluläre Lokalisierung des menschlichen neuronalen α7 AcCho-Rezeptors (α7 AcChoR) und seiner L248T-mutierten (mut) Form wurden untersucht, indem sie allein oder als Genfusion mit der verstärkten Version des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) exprimiert wurden. Xenopus-Oozyten, denen Wildtyp-, mutα7- oder die chimären Untereinheiten-cDNAs injiziert wurden, exprimierten Rezeptoren, die bei Exposition mit AcCho Membranströme auslösten. Wie bereits bekannt, klingen AcCho-Ströme, die von wtα7-Rezeptoren erzeugt werden, viel schneller ab als diejenigen, die von den mutα7-Rezeptoren ausgelöst werden. Das Zusammenspiel von β2-Nikotinrezeptoren und Dopaminwegen bei der Kontrolle der spontanen Fortbewegung und findet das Acetylcholin (ACh) ist ein bekannter Modulator der Aktivität von dopaminergen (DAergen) Neuronen durch die Stimulation von nAChRs. Die Zusammensetzung der Untereinheiten und die spezifische Lage der nAChRs, die an der DA-vermittelten Fortbewegung beteiligt sind, müssen jedoch noch in vivo bestimmt werden. Mäuse, denen die β2-Untereinheit der nAChRs fehlt (β2KO), zeigen eine auffällige Hyperaktivität im freien Feld, was auf ein Ungleichgewicht in der DA-Neurotransmission schließen lässt. Eine Mutation innerhalb der Domäne M2 des nikotinischen Rezeptors wandelt jedoch 5-Hydroxytryptamin von einem Antagonisten in einen Agonisten um. Die Studie untersuchte die Auswirkungen von 5-Hydroxytryptamin (5HT) auf homomere neuronale nikotinische Rezeptoren (nAcChoR), die in Xenopus-Oozyten nach Injektion von cDNA, die für die Wildtyp-Untereinheit des Huhns kodiert, exprimiert wurden. AcCho löste große Ströme aus, die durch 5HT in reversibler und dosisabhängiger Weise mit einer halbhemmenden Konzentration und einem Hill-Koeffizienten reduziert wurden. Obwohl der cholinerge Rezeptor zytotoxischer T-Lymphozyten und cholinerge Agonisten die Fähigkeit sensibilisierter Lymphozyten, Zellen zu verletzen, die die sensibilisierenden Alloantigene tragen, untersucht haben, wurde der cholinerge Rezeptor der angreifenden Lymphozytenpopulation mit pharmakologischer Manipulation eines In-vitro-Systems untersucht, das die von sensibilisierten angreifenden Zellen auf Zielzellen vermittelte Verletzung quantifiziert.