Von den DNA-Fragmenten, die wir ursprünglich zu amplifizieren versuchten, produzierten nur tlp2, che1P und cheA1 (Tabelle 1) ein PCR-Amplifikationsprodukt ohne die Verwendung von Lösungsmittelzusätzen, wenn genomische DNA von A. brasilense als Vorlage verwendet wurde (Abbildung 1). Zunächst wurden die Auswirkungen von DMSO in einer Konzentration von 1,25 %, 2,5 %, 5,0 %, 7,5 % und 10 % (w/vol) sowie von Formamid in ähnlichen Konzentrationen als PCR-Zusatz getestet (Abbildung 1). Eine Reihe von PCR wurde auch mit BSA in einer Konzentration von 1-10 μg/μl durchgeführt (Daten nicht gezeigt). In Übereinstimmung mit den Daten aus der Literatur führte sowohl die Zugabe von DMSO als auch von Formamid in der PCR zu einer erhöhten Ausbeute bei der Amplifikation von DNA-Fragmenten von 2-3 kb, wobei die verstärkende Wirkung von DMSO größer war als die von Formamid (Abbildung 1). Unter diesen Bedingungen beobachteten wir auch, dass eine Erhöhung der DMSO-Konzentration zu einer Abnahme der PCR-Spezifität führen konnte (Abbildung 2). Andererseits nahm die Wirkung von Formamid auf die PCR-Ausbeute bei DNA-Fragmenten, die größer als 2,5 kb waren, ab (Abbildung 1). Die Zugabe von BSA allein als PCR-Additiv hatte unter diesen Bedingungen keine signifikante Wirkung, auch nicht nachteilig (Daten nicht gezeigt). Die verstärkende Wirkung von BSA auf die PCR-Ausbeute wurde bei Verwendung in Kombination mit DMSO oder Formamid über einen breiten Bereich von DNA-Fragmentgrößen festgestellt (Abbildung 2). Darüber hinaus erweiterte die Zugabe von BSA den Konzentrationsbereich, in dem das organische Lösungsmittel zugesetzt werden konnte, sogar für DNA-Vorlagen größerer Größe (Abbildung 2). Die derzeitige Literatur über Formamid zeigt, dass es als PCR-Zusatzstoff am wirksamsten ist, wenn es in Konzentrationen von 0 bis 5 % verwendet wird, wobei die Wirksamkeit bei 10 % vollständig abfällt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Formamid in Gegenwart von BSA zumindest bis zu einer Konzentration von 10 % und bei DNA-Vorlagen mit einer Größe von bis zu 2,5 kb (tlp2) wirksam ist; die Amplifikation von DNA-Fragmenten größerer Größe wurde jedoch nicht gefördert (Abbildung 1). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der gemeldeten Wirkung von Formamid, das bei DNA-Template-Amplifikationen bis zu einer Größe von etwa 2,5 kb am effizientesten ist, und unterstützt die Annahme, dass DMSO und Formamid die PCR-Ausbeute durch unterschiedliche Mechanismen steigern. Unabhängig von diesen Unterschieden schien die Zugabe von BSA zu dieser PCR die positiven Effekte, die bei der Verwendung eines der beiden Lösungsmittel als PCR-Zusatzstoff beobachtet wurden, weiter zu fördern und zu erweitern. Angesichts der potenziellen negativen Auswirkungen, die hohe Konzentrationen organischer Lösungsmittel auf empfindliche nachgeschaltete Anwendungen wie Sequenzierung oder Klonierung haben können, ist die verstärkende Wirkung des BSA-Zusatzes von Bedeutung. Um einen Einblick in die Wirkung von BSA als Co-Enhancer mit DMSO oder Formamid zu erhalten, haben wir die Wirkung des BSA-Zusatzes auf die Amplifikationsausbeute über 10, 15, 20, 25 und 30 PCR-Zyklen analysiert. Diese Analyse bestätigte, dass die Zugabe von DMSO oder Formamid, aber nicht von BSA allein, zu einer Erhöhung der Ausbeute führt (Abbildung 3). Wenn BSA als Co-Enhancer mit DMSO oder Formamid verwendet wurde, konnte eine Erhöhung der Ausbeute nur in den ersten 15 Zyklen für alle Templates festgestellt werden (Abbildung 3). Diese Steigerung reichte von 10,5 % (che1P) bis zu 22,7 % (cheA1) im Verlauf der ersten 15 Zyklen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die effektive BSA-Konzentration mit der Größe des amplifizierten DNA-Fragments bis zu einer maximalen BSA-Konzentration (10 μg/μl) anstieg, bei der keine weitere Steigerung der Ausbeute festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde auch bei der höchsten BSA-Konzentration, die unter diesen Bedingungen zugesetzt wurde, kein Rückgang der Ausbeute beobachtet (Abbildung 4). Die zyklusbegrenzte Steigerung der PCR-Ausbeute durch BSA deutet darauf hin, dass dieses Protein im Laufe der Zeit denaturiert werden könnte und dadurch seine Wirksamkeit verliert. Um diese Hypothese zu testen, wurde eine PCR durchgeführt, bei der DMSO oder Formamid mit BSA im anfänglichen Reaktionspuffer in den oben ermittelten wirksamsten Konzentrationen kombiniert und für 10 Zyklen durchgeführt wurde, bevor eine neue BSA-Lösung (0-10 μg/μl Endkonzentration) zugegeben wurde. Die BSA-Zugabe wurde über 30 PCR-Zyklen wiederholt, und die Auswirkungen auf die Ausbeute wurden wie oben beschrieben analysiert. Eine nachhaltige Steigerung der Ausbeute konnte festgestellt werden, wenn BSA bei jedem zehnten PCR-Zyklus zugegeben wurde: Bei der Amplifikation von cheA1 wurde beispielsweise eine Steigerung der PCR-Ausbeute um fast 75 % gegenüber der mit Lösungsmittel allein erzielten Ausbeute erzielt (Abbildung 4). Die Ergebnisse der von uns als „BSA-PCR-Schritt“ bezeichneten Methode stimmen mit der Annahme überein, dass die BSA-Denaturierung den Rückgang der ertragssteigernden Wirkung nach dem fünfzehnten PCR-Zyklus verursacht. Kontrollversuche, bei denen Glycerin oder destilliertes steriles Wasser bei jedem zehnten Zyklus zugegeben wurde, führten nicht zu einer Erhöhung der PCR-Ausbeute, was darauf hindeutet, dass die Auswirkungen von BSA nicht auf eine Änderung des Reaktionsvolumens oder darauf zurückzuführen sind, dass BSA effektiv als molekularer Crowder wirkt, eine Eigenschaft, die einigen der Auswirkungen von Glycerin in der PCR zugeschrieben wird. Während die genauen Mechanismen der verstärkenden Wirkung von BSA auf die PCR-Ausbeute nicht bekannt sind, unterstützen die hier gewonnenen und in der Literatur beschriebenen Daten die Hypothese, dass BSA die DNA-Polymerase stabilisieren und/oder den potenziell hemmenden Auswirkungen hoher Konzentrationen organischer Lösungsmittel auf die DNA-Polymerase-Aktivität entgegenwirken kann. Bei der Amplifikation von cheA4, dem in dieser Studie verwendeten DNA-Fragment mit dem höchsten GC-Gehalt (73 %), wurde durch die Zugabe von BSA und DMSO zur PCR zwar eine Steigerung der PCR-Ausbeute erzielt, es wurden jedoch auch mehrere unspezifische Amplifikationsprodukte nachgewiesen (Abbildung 5). Um dieses Problem zu lösen, wurde die BSA-PCR-Methode als nächstes in Kombination mit einem „Touchdown“-PCR-Protokoll verwendet, das nachweislich die PCR-Spezifität verbessert. Diese Methode erzeugte eine einzige spezifische Bande und verdoppelte nahezu die Ausbeute, die durch die Verwendung des „Touchdown“-Protokolls plus organische Lösungsmittel allein erzielt wurde (96 % Steigerung) (Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigten uns auch eine Möglichkeit auf, die relativ geringe Effizienz der im QuickChange Stratagene Mutagenesis Kit (Stratagene) beschriebenen Methode der ortsgerichteten Mutagenese ganzer Plasmide zu verbessern, um eine Mutation in eine GC-reiche DNA-Vorlage einzuführen (hier das tlp2-Gen, ein 2,5 kb großes Fragment mit 66% GC). Als wir pUCtlp2 als Vorlage für die ortsgerichtete Mutagenese zusammen mit mutagenen Primern, die für die Einführung einer Substitution eines einzelnen Basenpaares in tlp2 bestimmt sind (mutagene Primer gemäß der Website des Herstellers), und dem Protokoll des Herstellers verwendeten, war das 5,324 kb große Fragment, das pUCtlp2 entspricht, kaum sichtbar (Abbildung 5). Nach Abschluss des Mutageneseprotokolls gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde entweder keine Kolonie oder eine kleine Anzahl von Kolonien (im Durchschnitt weniger als 5) erhalten, die Elternplasmide enthielten, denen die gewünschte Mutation fehlte. Diese Art von Ergebnis, das durch eine geringe Ausbeute der Mutagenese gekennzeichnet ist, wurde bereits früher als ein häufiger Fallstrick dieser Methode erkannt. Wurde jedoch alle fünf Schritte BSA zum Puffer des Herstellers hinzugefügt, konnte ein eindeutiges Amplifikationsprodukt nachgewiesen werden (Abbildung 5). Nach Abschluss des Herstellerprotokolls erhielten wir über 100 Kolonien, von denen 2/3 die gewünschte Mutation trugen (bestimmt durch Sequenzierung). Wir wendeten den BSA-PCR-Schritt auch in einem Overlap-Extension-Protokoll an, um eine chimäre Proteinfusion zwischen einem A. brasilense-Gen (ATM, 650 bp) und dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) (720 bp) zu konstruieren. Bei der Overlap-Extension-PCR werden zunächst zwei Primerpaare verwendet, um zwei zu fusionierende DNA-Fragmente zu amplifizieren, die eine kurze überlappende Sequenz aufweisen. In einer dritten Amplifikation werden die Amplifikationsprodukte der ersten Reaktionen zusammen mit den äußersten Reverse- und Forward-Primern als Templates verwendet, um chimäre Konstrukte zu erzeugen. Die Amplifikation der ersten beiden DNA-Fragmente, ATM und CFP, war mit Standard-PCR-Protokollen sehr effizient, und mit dem BSA-PCR-Schritt-Protokoll konnte keine signifikante Steigerung erzielt werden (Daten nicht gezeigt). Der zweite, überlappende PCR-Schritt erzeugte jedoch zahlreiche unspezifische Amplifikationsprodukte und wenig, wenn überhaupt, das gewünschte chimäre Amplikon (ATM-CFP; Tabelle 1) (Abbildung 5). Die unspezifischen Amplifikationsprodukte verschwanden bei Verwendung der „Touchdown“-PCR-Methode, aber das spezifische gewünschte chimäre Amplikon blieb in sehr geringer Menge erhalten, wie an einer sehr schwachen 1.370 bp ATM-CFP-Bande zu erkennen ist (Abbildung 5). Die Verwendung der BSA-PCR-Schritt-Methode zusammen mit einem „Touchdown“-Protokoll führte zu einer 72%igen Steigerung der Ausbeute des chimären ATM-CFP-Amplikons (Abbildung 5). Die anschließende Klonierung und Sequenzierung bestätigte, dass das korrekte chimäre Konstrukt erhalten wurde.
Auswirkungen von DMSO und Formamid auf die PCR-Amplifikation von GC-reichen Vorlagen. Typische Beispiele für die Auswirkungen der Zugabe von DMSO und Formamid in verschiedenen Konzentrationen auf die PCR-Amplifikation von 2-3 kb GC-reichen DNA-Vorlagen. A) Wirkung von DMSO auf die PCR-Amplifikation von che1P (oben) und tlp2 (unten), beobachtet durch Gelelektrophorese der gesamten PCR-Produkte. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt und fotografiert. B) Wirkung von Formamid auf die PCR-Amplifikation von che1P (oben) und tlp2 (unten) in vergleichbaren Experimenten.
PCR-Ausbeute steigernde Wirkung von BSA als Co-Additiv mit organischen Lösungsmitteln. Typische Beispiele für die Auswirkungen von BSA als Co-Additiv mit DMSO und Formamid in verschiedenen Konzentrationen auf die PCR-Amplifikation von GC-reichen DNA-Vorlagen. A) Wirkung von DMSO auf die PCR von che1P (links) und kombinierte Wirkung von DMSO mit 6 μg/μl BSA (rechts), beobachtet durch Gelelektrophorese des gesamten PCR-Produkts. B) Auswirkungen von Formamid auf die PCR-Amplifikation von che1P (links) und kombinierte Wirkung von Formamid mit 6 μg/μl BSA (rechts) in vergleichbaren Experimenten.
Wirkung der Zugabe von BSA als Co-Enhancer mit organischen Lösungsmitteln auf die PCR-Ausbeute. Die Steigerung der PCR-Ausbeute wird im Verhältnis zur PCR-Ausbeute ohne Zusatzstoff angegeben. Für alle Tafeln gilt folgende Legende: rote Linie, nur DMSO (7,5%); grüne Linie, nur Formamid (2,5%); violette Linie, DMSO (7,5%) und BSA (6 μg/μl); hellblau, Formamid (2,5%) und BSA (6 μg/μl). A) PCR-Amplifikation von che1P (392 bp); B) PCR-Amplifikation von tlp5P (798 bp); C) PCR-Amplifikation von tlp2 (2.638 bp); D) PCR-Amplifikation von cheA1 (3.389 bp); E) PCR-Amplifikation von cheOP1 (7.103 bp).
Wirkung von BSA als Co-Additiv mit organischen Lösungsmitteln, wenn es bei Zwischenschritten der PCR hinzugefügt wird. A) Auswirkung des BSA-Zusatzes auf die PCR-Ausbeute, wenn er alle zehn Zyklen für DNA-Fragmente eines breiten Größenbereichs (392 bp bis 7.103 bp) zugesetzt wird; B) Repräsentatives Beispiel für die Auswirkung des BSA-Zusatzes auf die PCR-Amplifikation von cheA1 (3.389 bp) in Anwesenheit von DMSO, wie durch Analyse der durch Gelelektrophorese amplifizierten DNA-Fragmente nachgewiesen.
Wirkung von BSA als Co-Additiv mit organischen Lösungsmitteln in verschiedenen PCR-Anwendungen. A) Ein repräsentatives Beispiel für die Wirkung des BSA-Zusatzes (BSA Step) als Co-Verstärker des DMSO-Effekts auf die PCR-Amplifikation von cheA4 in einem „Touchdown“-PCR-Protokoll, wie durch Gelelektrophorese nachgewiesen. B) Ein repräsentatives Beispiel für die Wirkung des BSA Step-Protokolls bei der PCR-Amplifikation von pUCtlp2 im Rahmen der ortsgerichteten Mutagenese (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene), nachgewiesen durch Gelelektrophorese. C) Ein repräsentatives Beispiel für die Wirkung des BSA Step-Protokolls, das bei einer PCR-Anwendung mit Überlappungsextension verwendet wurde, bei der ATM mit CFP fusioniert wurde, um ATM-CFP zu erhalten, wie durch Gelelektrophorese nachgewiesen wurde.