Abstract
Im Jahr 1992 berichteten wir über eine neue Methode zur Sequenzierung von Proteinen vom Carboxy-Terminus (C-Terminus) aus (Boyd et al., 1992). In den letzten zwei Jahren haben wir unsere Untersuchungen fortgesetzt, einschließlich des Mechanismus der anfänglichen Aktivierung der C-terminalen Carboxylgruppe und der gezielten Modifikationen der reaktiven Seitenketten der Aminosäuren mit den Sequenzierungsreagenzien. Durch die Auswahl der Reagenzien und Reaktionsbedingungen, die für unser Sequenzierungsprotokoll verwendet werden, werden Asparaginsäure, Glutaminsäure, Serin und Threonin derivatisiert. Die Amidierung von Asparaginsäure und Glutaminsäure und die Acetylierung von Serin und Threonin haben zu einer verbesserten Ausbeute bei der Sequenzierung dieser Reste geführt. Asparaginsäure und Glutaminsäure werden nun, wie in Tabelle 1 zu sehen, als Aminosäurereste eingestuft, die sich leicht sequenzieren lassen. Unser Kriterium für die Bestimmung, ob ein Rest zuverlässig genannt wird, ist die Fähigkeit, diesen Rest zu sequenzieren und nachzuweisen, wenn er in einem Nanomol einer Proteinprobe vorhanden ist. Im Durchschnitt ist es möglich, 5 Zyklen an einem Nanomol Protein zu sequenzieren, das auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran aufgebracht wurde, wenn die Aminosäuresequenz die in der Spalte „zuverlässig genannt“ in Tabelle 1 aufgeführten Reste enthält. Unser Schwerpunkt für die MPSA-Konferenz 1994 ist es, den derzeitigen Nutzen dieser C-terminalen Sequenzierungsmethode bei der Sequenzierung von auf PVDF immobilisierten Proteinen zu illustrieren.