Subklinische Hirnschädigung durch H5N1-Influenzavirus-Infektion

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Humane Influenzaviren infizieren in der Regel die oberen Atemwege und verursachen Niesen, laufende Nase und Husten sowie Fieber, Unwohlsein und Arthralgie (22). Darüber hinaus wurde auch über neurologische Komplikationen berichtet, wenn ein neuer Subtyp des Influenzavirus in die menschliche Bevölkerung eingeschleppt wird, wie bei der spanischen (1918) und der asiatischen (1957) Pandemie (2-4, 6, 10, 18, 22).

Im Jahr 1997 verursachte das Influenzavirus H5N1, das von Geflügel stammt, einen Ausbruch beim Menschen. Seitdem haben sich weltweit mehr als 500 Menschen mit H5N1-Viren infiziert, mit einer Sterblichkeitsrate von etwa 60 % (21). Eine Infektion mit dem H5N1-Virus äußert sich beim Menschen in der Regel als schwere Lungenentzündung, die sich zu einem akuten Atemnotsyndrom entwickelt; bei einigen Opfern des H5N1-Virus sind jedoch auch neurologische Störungen aufgetreten (1). H5N1-Virus-RNA und -Antigene wurden im Gehirn von Patienten nachgewiesen, und das Virus selbst wurde aus der Liquorflüssigkeit isoliert (5, 7). Diese Daten legen nahe, dass einige H5N1-Viren beim Menschen eine Enzephalitis auslösen könnten, wie es in den frühen Phasen der spanischen und asiatischen Pandemien der Fall war.

Frettchen stellen ein nützliches Säugetiermodell für Influenzainfektionen dar, da sie sehr empfänglich für eine Infektion mit Influenzaviren sind und einige der beim Menschen auftretenden Grippesymptome entwickeln (8, 12, 14, 16, 19). Die Neuroinvasivität eines H5N1-Influenzavirus nach intranasaler Exposition wurde auch in einem Frettchenmodell berichtet (23). Um die langfristigen neurologischen Auswirkungen einer H5N1-Virusinfektion zu untersuchen, infizierten wir Frettchen mit H5N1-Viren, die bei diesen Tieren leichte Symptome hervorrufen, und beobachteten die Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem (ZNS) über einen Zeitraum von 9 Monaten. Außerdem wollten wir den Weg aufklären, über den diese H5N1-Viren in das ZNS eindringen.

Sechs Monate alte Frettchen wurden intranasal mit 106 PFU des A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) oder A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486) Virus geimpft. Diese Viren wurden in Madin-Darby-Hundenieren-Zellen (MDCK) in minimalem essentiellem Medium, ergänzt mit 0,3 % Rinderserumalbumin, vermehrt. An den Tagen 3, 6 und 12 sowie in den Monaten 1, 3, 6 und 9 nach der Infektion entnahmen wir Gewebeproben zur Virusisolierung und pathologischen Untersuchung. Die Frettchen waren lethargisch und zeigten in den ersten 10 Tagen nach der Infektion Anzeichen und Symptome einer Atemwegsinfektion, aber keine nennenswerten neurologischen Anzeichen, was im Gegensatz zu früher berichteten Ergebnissen steht (23). Gewebeproben aus Nasenmuscheln, Lunge, Luftröhre, Gehirn, Leber, Milz, Nieren, Herz, Bauchspeicheldrüse und Rückenmark wurden entnommen und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu einer 10%igen Suspension homogenisiert. Der Virustiter in jedem Gewebe wurde mit Hilfe von Plaque-Assays bestimmt. Die Viren vermehrten sich hauptsächlich in den Nasenmuscheln, wobei die Virustiter nach 3 bis 6 Tagen p.i. 105 bis 106 PFU/Gramm Gewebe erreichten (Tabelle 1). Hirngewebe von HK483- oder HK486-infizierten Frettchen wurde in 10 % neutral gepuffertem Formalin konserviert und für die Paraffineinbettung aufbereitet. Die in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden in 5 mm dicke Scheiben geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Zusätzliche Schnitte wurden für die immunhistologische Färbung mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen ein H5-Influenzavirus angefertigt. Die histologische Untersuchung ergab eine neuronale Invasion oder Schädigung, einschließlich einer Entzündung des Plexus choroideus (Tabelle 2). Mit dem HK486-Virus infizierte Frettchen zeigten Anzeichen einer nicht-suppurativen Entzündung (Abb. 1a) und eine virale Antigenexpression (Abb. 1b), die 12 Tage lang anhielt; virale Antigene wurden nach einem Monat p.i. nicht mehr nachgewiesen. Die nicht-suppurative Enzephalitis hielt drei Monate lang an (Abb. 1c), wobei nach sechs und neun Monaten p.i. in den Bereichen, in denen in der früheren Phase virale Antigene nachgewiesen wurden, eine restliche gliale Vernarbung zu erkennen war (Abb. 1d). Darüber hinaus zeigten Frettchen, die mit HK486 infiziert waren, am 12. Tag p.i. makroskopische Schädigungen des olfaktorischen Systems (Abb. 1e und f). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hochpathogene H5N1-Viren zwar hauptsächlich die Atemwege des Wirts beeinträchtigen (1), aber auch neurologische Komplikationen hervorrufen können. Im Gegensatz zum Virus HK486, das in das Gehirnparenchym von Frettchen eindrang und schwere parenchymale Schäden verursachte, verursachte der zweite H5N1-Stamm, HK483, eine schwere nicht-suppurative Vaskulitis ohne erkennbare parenchymale Schäden im Gehirn von Frettchen nach 6 Tagen p.i. Obwohl innerhalb des Gefäßsystems kein virales Antigen nachgewiesen werden konnte, war eine Gefäßschädigung erkennbar, die durch eine Endothelschwellung (Abb. 2a, Pfeilspitzen), verstreute apoptotische Zellen (Abb. 2b, Pfeilspitzen) und eine intramurale Infiltration von Makrophagen (Abb. 2a, Pfeile) und polymorphkernigen Leukozyten (Abb. 2b, Pfeil) gekennzeichnet war. Vaskuläre Läsionen fanden sich im Thalamus, an der Grenze zwischen grauer und weißer Substanz und im Hirnstamm. Hirnproben, die nach 1 und 6 Monaten p.i. untersucht wurden, wiesen hämorrhagische Läsionen auf, die auf chronische und wiederholte perivaskuläre Blutungen (Abb. 2c) im Thalamus, Kleinhirn und Subarachnoidalraum des Vorderhirns hinwiesen (Abb. 2d). Diese Beobachtungen stimmen mit Berichten über durch Influenzaviren ausgelöste hämorrhagische Hirnkomplikationen während jährlicher Epidemien überein (11). Hirnvaskulitis als Folge einer Virusinfektion ist relativ häufig (17) und ist wahrscheinlich die Ursache für die Fragilität der Gefäßwände, die zu Hirnblutungen führt. Daher liegt der Schluss nahe, dass eine Infektion mit dem H5N1-Virus beim Menschen ähnliche Hirnblutungen verursachen kann wie bei einer Infektion mit anderen neurotropen Viren.

Um den Weg zu untersuchen, über den H5N1-Viren in das Gehirn von Frettchen eindringen, haben wir die Verteilung von Hirnläsionen und die Expression viraler Antigene bei Frettchen analysiert, die mit den Viren HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) und A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18) infiziert waren. Die Viren HK213, VN1204 und NCVD18 wurden in MDCK-Zellen in minimalem essentiellem Medium vermehrt, das mit 0,3 % Rinderserumalbumin ergänzt wurde. Sechs Monate alte Frettchen wurden intranasal mit 106 PFU des Virus geimpft. Hirngewebe wurde in der akuten Phase, bei VN1204 und NCVD18 3 und 6 Tage nach der Infektion und bei HK213 zusätzlich 12 Tage nach der Infektion entnommen. Die Gewebe wurden für die H&E-Färbung und die Immunhistochemie zur histologischen Untersuchung aufbereitet. Die von VN1204, NCVD18 und HK213 verursachten Hirnparenchymläsionen waren durch eine nicht-suppurative Enzephalitis gekennzeichnet, und das Expressionsmuster der viralen Antigene war im Wesentlichen dasselbe wie bei HK486 (Daten nicht gezeigt). Um die dreidimensionale (3D) Verteilung der Hirnläsionen und der viralen Antigene zu verstehen, stellten wir sie mit Hilfe der 3D-Bildgebung (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japan) des Gehirns eines gelben Mungos (Cynictis penicillata) dar, dessen Architektur der des Frettchengehirns sehr ähnlich ist (20). Um die Riechbahn (d. h. die Sinnesbahn für den Geruchssinn) zu visualisieren, markierten wir die Nervenbahnen vom Riechkolben zum piriformen Kortex auf den 3D-Bildern als Referenzrahmen (Abb. 3a, gelb; siehe auch Film S1 im Zusatzmaterial). Wir fanden drei verschiedene Muster von Hirnläsionen mit und ohne virale Antigene, die durch die verschiedenen H5N1-Influenzaviren verursacht wurden: solche, die nur entlang der Riechbahn (Abb. 3b und c, gestrichelte gelbe Linie; siehe auch Filme S2 und S3) verteilt waren (HK213 und NCVD18); solche, die entlang der Riechbahn nachgewiesen wurden (Abb. 3d und e, gestrichelte gelbe Linie). 3d und e, gestrichelte gelbe Linie; siehe auch Filme S4 und S5) und im Hirnstamm (Abb. 3d und e, weiße Pfeile; siehe auch Filme S4 und S5) (HK486 und VN1204); und solche in anderen Bereichen (Abb. 3f; siehe auch Film S6) (HK483). Die Grundlage für die Unterscheidung der dritten Gruppe von Läsionen von den anderen beiden Gruppen wird deutlicher, wenn die Verteilung der Läsionen von hinten betrachtet wird (Abb. 3g und h, gelb versus blau versus rot). Diese Kartierungsergebnisse zeigen, dass die meisten der von uns getesteten H5N1-Stämme über die Riechbahn in das Gehirn eingedrungen sind (Abb. 3, gestrichelte gelbe Linie). Eine Ausnahme bildete der Stamm HK483 (Abb. 3f), der bei Frettchen eindeutig auf die Hirngefäße abzielte und Läsionen außerhalb des Geruchssystems verursachte.

Bevor H5N1-Viren pandemisch werden können, müssen sie wahrscheinlich die Fähigkeit erlangen, im oberen Teil der menschlichen Atemwege gut zu wachsen, was zu einer effizienten Übertragung von Mensch zu Mensch durch Niesen und Husten führen würde (13, 22). Unsere Daten von Frettchen deuten darauf hin, dass hochpathogene H5N1-Viren, wenn sie beim Menschen Fuß fassen, subklinische neurologische Komplikationen verursachen könnten, indem sie über die Nervenbahnen in das Gehirn eindringen oder eine Hirnvaskulitis verursachen. Zuvor wurde ein H3N2-Virus in Frettchengehirnen nachgewiesen; die Virusmenge in den Gehirnen war jedoch gering (weniger als 102,2 log10 50 % eierinfektiöse Dosen) und es wurde kein Nachweis von Virusantigenen im Gehirn gemeldet (23). Wir fanden heraus, dass sich das pandemische H1N1-Virus von 2009 in den Atemwegen von Frettchen effizienter replizierte als ein menschliches saisonales H1N1-Virus (9, 13, 15) und nicht-suppurative Läsionen des Riechkolbens verursachte; wir fanden jedoch kein Virus im Gehirnparenchym dieser Tiere (Daten nicht gezeigt). Die Invasion des Hirnparenchyms, die durch das Vorhandensein viraler Antigene nachgewiesen wurde, ist daher ein Merkmal der H5N1-Viren. Es wäre daher sinnvoll, retrospektive und prospektive Studien zu subklinischen neurologischen Komplikationen bei mit dem H5N1-Virus infizierten Patienten durchzuführen. Unsere Ergebnisse geben Anlass zur Sorge, dass subklinische neurologische Komplikationen mit schweren Atemwegsinfektionen einhergehen könnten, wenn sich H5N1-Viren weltweit ausbreiten.