Transcriptomic analysis of grain amaranth (Amaranthus hypochondriacus) using 454 pyrosequencing: comparison with A. tuberculatus, Erstellung von Expressionsprofilen in Stängeln und als Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress

Roche GS-FLX und GS-FLXTM Sequenzierung und Assemblierung

Sechs Sequenzierungsläufe ergaben ≈910 Mb Gesamtdatenmenge, was 2.913.966 Rohdaten entspricht. Die Rohsequenzdateien sind im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?study=SRP006173 als Dateien SRR172675 (S1), SRR172676 und SRR183482 (S2), SRR172677 (S3), SRR172678 und SRR183483 (S4), SRR172679 (S5) und SRR172680 (S6) verfügbar. Die Längenhäufigkeitsverteilung der Rohleseproben lag im Bereich von 200 bis 300 bp und 300 bis 400 bp, was auf die Verwendung von zwei verschiedenen Plattformen für die Sequenzierung zurückzuführen ist (Abbildung 1A). Insgesamt wurden 2.700.168 Reads (93 % der Gesamtzahl) assembliert, die 21.207 hochqualitative assemblierte Sequenzen ergaben (20.408 Isotigs + 799 Contigs¸ das entspricht 87 % der Reads, die in die Assemblierung eingehen, und ≈82 % aller assemblierten Sequenzen). Diese reichten von 80 bis 3.379 bp (Abbildung 1B) und hatten eine durchschnittliche Sequenzlänge von 1.014 bp (isotigs) und 930 bp (contigs). Insgesamt 178.636 Reads (≈6 % der Gesamtmenge) blieben als Singletons übrig (Abdeckungstiefe = 1); von diesen blieben nach der Qualitätskontrolle nur 5.113 saubere Sequenzen übrig. Die Isotigs wurden weiter in 15.667 Isogruppen zusammengefasst. Eine Zusammenfassung des Sequenzierungs-, Assemblierungs- und Annotationsprozesses (siehe unten) findet sich in Tabelle 1.

Annotation von A. hypochondriacus Contigs/Isotigs

Alle Contigs/Isotigs wurden zur Annotation mit den Datenbanken nr, TAIR, UniRef100, UniRef50 und Amaranthaceae ESTs und PFAM abgeglichen. Etwa 82 % aller Einträge ergaben signifikante Treffer (E ≤ 1 × 10-10), wenn sie mit der nr-Datenbank abgefragt wurden (Tabelle 1). Die 3.901 Sequenzen ohne signifikanten Treffer in der nr-Datenbank wurden mit der PFAM-Proteindomänen-Datenbank abgeglichen, um ihre mutmaßliche Funktion zu bestimmen. Nur ein kleiner Teil dieser Sequenzen (≈2 %) ergab signifikante Treffer (E-Werte ≤ 1 × 10-5) zu bekannten Proteindomänen. Diese Ergebnisse sind in Zusatzdatei 1 zu finden. Die Annotation der 5.113 sauberen Singletons in der TAIR-Datenbank ergab etwa 1.000 signifikante Treffer.

Der beste Treffer für jedes in der TAIR-Datenbank abgefragte Unigen wurde verwendet, um funktionelle GO-Annotation in Bezug auf biologische Prozesse (11.224 Sequenzen), molekulare Funktionen (11.499 Sequenzen) und zelluläre Komponenten (11.227 Sequenzen) zuzuordnen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 zusammengefasst. Wie erwartet, entfiel der größte Anteil in jeder GO-Gruppe (12 % bis 15 %) auf Contigs/Isotigs mit unbekannter funktioneller Annotation. Es wurden keine offensichtlichen Unterschiede in der Anzahl der Sequenzen, die den einzelnen Kategorien zugeordnet wurden, einschließlich der Reaktion auf (a)biotischen Stress, zwischen Amaranth und Arabidopsis thaliana festgestellt. Dies spiegelt wahrscheinlich die bekannte Fähigkeit von Arabidopsis wider, stark auf abiotischen und biotischen Stress auf der Transkriptionsebene zu reagieren. Dieses Ergebnis spricht auch gegen die Möglichkeit, dass Getreide-Amaranth eine andere transkriptomische Signatur besitzt, insbesondere in den Kategorien Stress und Reaktion auf Stimuli, die seine charakteristische (a)biotische Stresstoleranz erklären könnte, im Gegensatz zu dem, was bei Pflanzenarten beobachtet wurde, die an extreme Lebensräume angepasst sind (z. B. der mit Arabidopsis verwandte Halophyt Thellungiella halophila und extremophile Mangroven). Die funktionelle GO-Zuordnung für biologische Prozesse (Abbildung 2A) zeigte, dass 3 % der Contigs/Isotigs unter Stress-/Reizreaktionen, 2 % unter Entwicklungsprozesse und weitere 4 % unter andere biologische und metabolische Prozesse fielen. Diese Kategorien waren für uns von besonderem Interesse, da eines der Hauptziele dieser Transkriptomstudie darin bestand, Informationen zu liefern, die zur Identifizierung von (a)biotischen, auf Stress reagierenden Genen führen (siehe unten). Von der Anzahl der Transkripte, denen eine Verteidigungsrolle zugewiesen wurde (1 % der Gesamtzahl), waren mehr als die Hälfte mit bakterieller Infektion (41 %) und Jasmonsäure (JA)-Regulierung (24 %) verbunden, darunter viele JA-Biosynthesegene (z. B. LOX13, AOS, AOC, OPR3) und JA-responsive Gene (Abbildung 3A; siehe auch zusätzliche Dateien 2, 3 und 4).

Die obigen Informationen zeigen, dass Getreide-Amaranth ein vielfältiges Arsenal an Genen zur Resistenz gegen Pathogeninfektionen und Insektenherbivorie besitzt, von denen die meisten zum ersten Mal bei dieser Art nachgewiesen wurden. Dazu gehören Gene, die möglicherweise an der Oxalat- und Phytoecdysteroid-Synthese beteiligt sind (Ergebnisse nicht gezeigt), die bei Amaranth und anderen Arten als wirksame Verteidigungswaffen gelten. Die Umsetzung einer relativ robusten Abwehrreaktion war etwas unerwartet, zumindest gegen Insektenherbivorie, wenn man bedenkt, dass die ungewöhnlich hohe Toleranz gegenüber Entlaubung, die wir bei A. hypochondriacus-Pflanzen beobachtet haben (siehe unten), diese Art von einer Investition in metabolisch kostspielige induzierbare Abwehrreaktionen (z. B. Proteaseinhibitoren und Lektine) befreien sollte. Die Art der isolierten pathogenresistenten Gene war ebenfalls komplex und umfasste eine ganze Reihe von bakteriellen und pilzlichen Elicitor-induzierten und mit der Pathogenese verbundenen Proteinen, extrazelluläre Rezeptoren, die denen ähneln, die an Elicitor-induzierten Abwehrreaktionen beteiligt sind, Proteasen, Transkriptionsfaktoren (TFs) und Enzyme, die an der Erzeugung und Entgiftung reaktiver Sauerstoffspezies beteiligt sind.

Ebenfalls wichtig waren aus unserer Sicht Gene, die möglicherweise an der kompensatorischen Photosynthese, der Re-Lokalisierung von Kohlenhydraten (Tabelle 2) und der Regulierung/Synthese von Phytohormonspiegeln (Abbildung 3B) beteiligt sind, was möglicherweise mit der verstärkten Verzweigung zusammenhängt, die bei Korn-Amaranth-Pflanzen als Reaktion auf Entlaubung durch Insektenherbivorie und/oder mechanische Schäden beobachtet wurde. Viele der identifizierten Gene können für die Untersuchung nicht verwandter Prozesse verwendet werden. Zum Beispiel wird die Analyse von Genen, die mit Phytohormonen in Verbindung stehen, in Kombination mit solchen, die eine Homologie mit blühenden Genen aufweisen, verfolgt, um einen Einblick in die genetischen Mechanismen zu erhalten, die für die verschiedenen Symptome verantwortlich sind, die durch Phytoplasma-Infektion von Korn-Amaranth im Feld erzeugt werden, einschließlich Phyllodie .

Transkriptom-Vergleich zwischen A. hypochondriacus und A. tuberculatus

Die öffentlich zugänglichen transkriptomischen 454-Pyrosequenzierungs-Rohdaten, die für A. tuberculatus generiert wurden, wurden mit denselben Berechnungsmethoden wie für A. hypochondriacus neu zusammengesetzt. Bei uns ergab die Assemblierung jedoch ein Verhältnis von Contigs/Singletons (12.216/53.803), das sich von dem der früheren Forscher (22.035/22.434) unterscheidet, was vielleicht auf die Verwendung unterschiedlicher Assembler zurückzuführen ist. Die Diskrepanz trat trotz der Tatsache auf, dass 83 % der gesamten A. tuberculatus-Rohdaten, die in den Prozess einflossen, assembliert wurden. Der BLASTN-Abgleich der resultierenden 12 216 A. tuberculatus-Contigs mit den 21 207 A. hypochondriacus-Isotigs/Contigs ergab 8 260 homologe Sequenzen (E ≤ 1 × 10-10 und ≥ 90% Identität). Die Anzahl der Contigs von jeder Art, die signifikante Treffer (E ≤ 1 × 10-10) ergaben, wenn sie mit den Datenbanken Uniref 100 und Amaranthaceae ESTs abgefragt wurden, ist in Tabelle 3 aufgeführt. Die kombinierte Verwendung der oben genannten Informationen führte zur Quantifizierung der Anzahl homologer Contigs, die denselben Treffer, unterschiedliche Treffer, einen Treffer für eine Art und keinen für die andere und umgekehrt sowie keinen Treffer ergaben. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Analyse der homologen Transkripte, die mit der EST-Datenbank der Amaranthaceae annotiert wurden, ergab, dass die meisten eine unbekannte Funktion/Herkunft hatten (21 %). Der höchste Anteil (71 %) wurde in EST-Bibliotheken gefunden, die aus unreifen Samen- und Blütengeweben von Chenopodium quinoa, Blütenständen, keimendem Gewebe, Wurzeln in verschiedenen Entwicklungsstadien, Hypokotylen, Samenstängeln und Keimblättern von Rübenwurzeln und Chlorenchymzellen der Nicht-Kranz C4-Art Bienertia sinuspersici gewonnen wurden. Stressbedingte Gene machten den kleinsten Anteil aus (8 %), der hauptsächlich aus ESTs von Salzstress-Halophytenarten (Salicornia brachiata, Suaeda salsa, S. maritima, Atriplex centralasiatica und C. glaucum) sowie aus ESTs von unreifem Gewebe von Salsola tragus stammte. Alle unter biotischem Stress identifizierten Transkripte stammten aus cDNA-Bibliotheken von Rübenwurzeln, die Madenfraß (Tetanops myopaeformis) ausgesetzt waren. Andererseits hatten zwei Drittel der homologen Transkripte, die in der Uniref100-Datenbank annotiert waren, eine unbekannte Funktion. Bei der anschließenden Klassifizierung der Transkripte (33 %), denen eine Funktion in der Kategorie biologische Prozesse zugewiesen wurde, wurde die Mehrheit von ihnen (16 %) in eine Gruppe eingeordnet, die aus grundlegenden Haushaltsfunktionen besteht (z. B. Organisation und Biogenese zellulärer Komponenten, Zellzyklus, Zelltod, Regulierung der Genexpression, Translation, zelluläre Homöostase, Morphogenese anatomischer Strukturen und Wachstum, Kohlenhydrat-, Protein- und DNA-Stoffwechselprozesse, Transport und Photosynthese), primärer und sekundärer Stoffwechsel (7 %), Signaltransduktion und Transkriptionsregulation (4 %). Der Rest umfasst Transkripte, die als Reaktion auf biotischen (2%) und abiotischen Stress (4%) exprimiert werden. Die Mehrheit der letzteren wurde aus Amaranthaceae und verwandten Halophyten isoliert, die hauptsächlich Salzstress ausgesetzt sind. Interessante Gene, die mit (a)biotischem Stress zusammenhängen und in beiden Arten vorhanden sind, umfassen ein Plastid-Lipid-assoziiertes Protein, von dem bekannt ist, dass es als Reaktion auf mehrere Stressfaktoren in vielen Pflanzenarten induziert wird, AtPOB1, ein BTB/POZ-Domänenprotein, das in Arabidopsis und Tabak Krankheitsreaktionen positiv reguliert, das Phloemsaftprotein AtPP2-A1, dessen Überexpression in Arabidopsis den Phloemfraß der Grünen Pfirsichblattlaus Myzus persicae stark unterdrückt, ein Transkript, das dem unspezifischen Lipid-Transferprotein Typ 2 von Tamarix hispida, dessen Expression als Teil einer adaptiven Reaktion auf abiotischen Stress bei dieser Art gefunden wurde, Polyaminoxidase, ein H2O2 produzierendes Enzym, das vermutlich an Zellwanddifferenzierungsprozessen und Abwehrreaktionen beteiligt ist und von dem kürzlich festgestellt wurde, dass es für die Wundheilung bei Mais erforderlich ist, Methioninsulfoxid-Reduktase, die bei der Abwehr von Krankheitserregern in Paprikapflanzen über die Regulierung des Redox-Status der Zellen aktiv ist, und die ATP-abhängige DEAD-Box-RNA-Helikase 7, eine Art von DNA-Reparaturprotein, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass es, wenn es in Pflanzen exprimiert wird, Mehrfachstress-Resistenz verleiht. Bemerkenswert war auch die Identifizierung mehrerer Gene, die mit der Schwermetallionen-Homöostase und -Toleranz, der Kationenentgiftung, dem Wassertransport und der stressbedingten Phytohormonbiosynthese (z. B. Abscisinsäure und JA) sowie der Signaltransduktion zusammenhängen (siehe Zusatzdatei 5).

Die Zahl der annotierten Transkripte, die nur bei einer Art entdeckt wurden, war vergleichsweise groß (Tabelle 5). Ein anschauliches Beispiel für die Unterschiede zwischen den Transkriptomen von Unkraut und Getreide-Amaranth ist die Analyse der Herbizid-Zielgene, die in den Datenbanken UniRef 100 und Amaranthaceae ESTs annotiert wurden. Sie ergab, dass 29 dieser Gene in beiden Arten gefunden wurden, während 13 und 8 Sequenzen nur in A. hypochondriacus bzw. A. tuberculatus gefunden wurden (Tabelle 6).

Die für den Transkriptom-Vergleich verwendeten recht strengen Parameter könnten zu den hier beobachteten Transkriptom-Unterschieden geführt haben, obwohl die Verwendung niedrigerer E-Wert-Schwellenwerte (z. B. E ≤ 1 × 10-5) möglicherweise nicht viel zur Erhöhung der Transkript-Homologie beigetragen hat, wie eine frühere Genom-Sequenzierungsstudie bei Eucalyptus grandis nahelegt. Eine andere, plausiblere mögliche Erklärung ist jedoch, dass die oben genannten Diskrepanzen auf grundlegende Unterschiede in der gesamten Versuchsplanung zurückzuführen sind, die zur Gewinnung beider Transkriptomdaten verwendet wurde. So wurden beispielsweise viele Gene, die mit biotischem Stress zusammenhängen, in A. hypochondriacus nachgewiesen, während sie in A. tuberculatus fehlten (Ergebnisse nicht gezeigt). Eine alternative Hypothese, die besagt, dass der beobachtete Unterschied auf eine wichtige Sequenzdivergenz während der Speziation/Domestikation zurückzuführen ist, erfordert weitere Untersuchungen, um sie zu bestätigen.

Digitales Expressionsprofiling

Stress-responsives Transkriptionsprofil in Blättern

Diese Technik, die auch als Tag-Sampling oder RNA-seq bekannt ist, gilt als effiziente Methode zur Analyse der Genexpression. Die digitale Expressionsprofilanalyse, die für A. hypochondriacus durchgeführt wurde, identifizierte insgesamt 1.971 differenziell exprimierte Gene als Reaktion auf mindestens eine der vier getesteten Stressbehandlungen (d. h. Wasserstress, Salzstress, Insektenherbivorie und bakterielle Infektion) (Additional file 6). Es wurden fünfzig verschiedene Genexpressionsprofile erstellt, um den Einfluss einer bestimmten Stressbehandlung auf das Expressionsniveau eines bestimmten Gens zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Ein offensichtliches Merkmal dieser Analyse war der hohe Prozentsatz an nicht annotierten Genen oder Genen mit unbekannter Funktion, die durch Stress induziert wurden. Diese stellen eine potenziell reiche Quelle genetischen Materials dar, das systematisch analysiert werden könnte, um Gene zu entdecken, die an neuartigen Mechanismen der Stressresistenz beteiligt sind.

Alle stressinduzierbaren Gene mit bekannter Funktion, die in 41 der 50 Genexpressionskategorien identifiziert wurden, wurden ebenfalls tabellarisch aufgeführt (Additional file 7). Dazu gehörten mehrere TFs, von denen bekannt ist, dass sie Stressreaktionen bei anderen Pflanzenarten regulieren, z. B. AREB-ähnliches Protein , Dof-Typ-Zinkfingerdomäne-enthaltendes Protein , BTB/POZ-Domäne-enthaltendes Protein , GRF-Zinkfinger-enthaltendes Protein , RAP 2.4-ähnliches Protein , JAZ1-Repressor , ATEBP/ERF72/RAP2.3 (verwandt mit AP2-3) , RAV , MYB-ähnlicher Transkriptionsfaktor , TINY-ähnliches Protein 2 , Cys2/His2-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor , der wenig bekannte GAGA-Motiv-bindende Transkriptionsaktivator ; SCOF-1-Zinkfingerproteine, die durch Kälte- oder Salzstress in Arabidopsis und anderen Pflanzen induziert werden und offenbar die ABRE-abhängige Genexpression verstärken , ein mutmaßlicher NAC-Transkriptionsfaktor und Histon-Fold/TFIID-TAF/NF-Y . Andere Faktoren wurden bei mehreren Xerophyten/Halophyten als mögliche Faktoren identifiziert, die zu ihrer Fähigkeit beitragen, extreme Lebensräume zu besiedeln, z. B. Lycopin-Synthase-Wasserkanalproteine , Myo-Inositol-1-Phosphat-Synthase, Cystathionin-Gamma-Synthase-Phosphoenolpyruvat-Carboxylase , Na+/H+-Antiporter , Protein-Phosphatase-2C , Ca2+/H+-Antiporter , Calcineurin-B-ähnliches Protein , Inositol-Monophosphatase und Salz-induziertes hydrophiles Protein .

Nicht überraschend wurde festgestellt, dass zahlreiche Transkripte, die für reaktive Sauerstofffänger kodieren, stark induziert werden, viele von ihnen durch Mehrfachstress, z. B. Superoxiddismutase, Glutathion-S-Transferase Z1, Germ-ähnliche Oxidase und mehrere Katalasen, Peroxidasen und Ascorbatperoxidasen. Auch die starke und mehrfache Stressinduktion von Aspartylprotease, verschiedenen Cysteinproteasen, einer Subtilisin-ähnlichen Protease und einem vakuolaren Verarbeitungsenzym (VPE) spricht für eine Rolle von Proteinrecyclingprozessen als Reaktion auf Stress, ähnlich wie dies während des Prozesses der Anpassungskompetenz an Salinitätsstress bei dem extremophilen T. halophila gefunden wurde, während die Expression von Expansinen, Xyloglucan-Endotransglykosylasen, mehreren Cellulose-Synthase-Untereinheiten, Glycin-, Prolin- und Hydroxyprolin-reichen Proteinen durch die beobachtete Fähigkeit zur Anpassung der Zellwandeigenschaften in vielen Pflanzen unter Stress unterstützt wird. Viele dieser kohlenhydrataktiven Gene wurden auch in den Stängeln stark exprimiert (siehe unten).

Von besonderer Bedeutung waren Gene, die bei verschiedenen Stressbehandlungen stark exprimiert wurden und über die bisher bei Amaranth oder verwandten Halophyllen/Extremophyllen nicht berichtet wurde. Diese haben ein offensichtliches Potenzial für biotechnologische Anwendungen und könnten auch zur Aufklärung der molekularen Mechanismen beitragen, die zur Resistenz gegen verschiedene Stressbedingungen führen. Eine Auswahl umfasst die folgenden: Drm3, das für die De-novo-DNA-Methylierung in Arabidopsis thaliana erforderlich ist und dort vermutlich Gen-Silencing-Prozesse reguliert; Enhancer of SOS 3- 1, der für ein in den Chloroplasten lokalisiertes Protein kodiert, das mit den kritischen SOS3- und SOS2-Regulatoren der Salzstresstoleranz in Arabidopsis interagiert; die Proteine YCF3 und HCF101 (High Chlorophyll Fluorescence 101), die als wesentlich für den Aufbau und die Akkumulation des Photosystem-I-Komplexes (PSI) und die Verhinderung von photooxidativen Schäden gelten; der Translationsinitiationsfaktor eIF1, der sich als Determinante der Natriumtoleranz in Hefe und Pflanzen erwiesen hat, was darauf hindeutet, dass die Translation ein Ziel der Salztoxizität ist und dass ihre Wiederherstellung ein entscheidender Mechanismus für das Überleben der Zelle unter NaCl-Stressbedingungen sein könnte, zusätzlich zu seiner vorgeschlagenen Regulierung der Ionenakkumulation und des intrazellulären Redoxstatus ; die ATP-abhängige FtsH-Protease 9, die am Abbau des D1-Proteins von PSII beteiligt ist, einem Schritt, der notwendig ist, um die Anhäufung übermäßiger Mengen reaktiver Sauerstoffspezies zu vermeiden; der ACD1-LIKE-Elektronentransporter, der dem Genprodukt für den beschleunigten Zelltod von Arabidopsis ähnelt und an der Sauerstoffanreicherung von Phäophorbid a beteiligt ist, das erforderlich ist, um die photooxidative Zerstörung der Zelle zu verhindern, und von dem ebenfalls festgestellt wurde, dass er während des Anpassungsprozesses an Salzstress in T. halophila hochreguliert wird; das Prohibitin-Gen PHB1, dessen Familienmitglieder als Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen in vielen Pflanzen akkumuliert werden, vermutlich um die Funktion und Integrität der Mitochondrien zu schützen, als Auslöser für die retrograde Mitochondrien-zu-Kern-Signalübertragung und/oder als Vermittler des Zusammenspiels zwischen H2O2 und NO durch einen noch nicht definierten Mechanismus; das „Yellow Stripe Like 6“-Protein, von dem angenommen wird, dass es an der Übertragung von Metall-Mikronährstoffen in und aus vaskulärem Gewebe sowie an der Metalltoleranz und -überakkumulation beteiligt ist; mutmaßliches Linker-Histon-H1-Variante-Protein, das unter Trockenstressbedingungen in Tomaten exprimiert wird und über einen anderen Mechanismus als die Chromatinorganisation wirkt, der vermutlich eine negative Regulierung der stomatären Leitfähigkeit beinhaltet; GASA-1/LtCOR1-like, ein Gibberellin-reguliertes Protein, das vermutlich an der Regulierung der Fruchtreife oder der Etablierung des Ruhezustands in kambialen Meristemen von Bäumen beteiligt ist ; Beta- und Gamma-Tubulinketten, deren Expression mit der immer wichtiger werdenden Rolle des Zytoskeletts bei der Vermittlung der Reaktion der Pflanzenzelle auf Stress zusammenfällt; der Translationsinitiationsfaktor 5A, der über einen weitgehend unbekannten Mechanismus an einer offenbar isoformabhängigen Regulierung der Stressreaktionswege und der Resistenz beteiligt ist; das Argonaute-4-ähnliche Gen, das primäre Protein, das an der Methylierung des Heterochromatins beteiligt ist und vor kurzem als kritischer Faktor für die durch kleine RNA vermittelte systemische Signalübertragung erkannt wurde, die für die pflanzliche Reaktion auf (a)biotischen Stress und Nährstoffentzug erforderlich ist; eine mutmaßliche Arginase, die die Rolle von Arginin als Vorläufer für die Biosynthese von Polyaminen und Stickstoffmonoxid hervorhebt, die als Botenstoffe für die Anpassung von Pflanzen an Stress eingesetzt werden, und das porenbildende toxinähnliche Lektinprotein Hfr-2, das als wichtiger biotischer Resistenzfaktor in Weizen gegen den Befall mit der Hessischen Fliege und gegen Pilzinfektionen (Puccinia striiformis) anerkannt ist und mit dem Wechsel der vegetativen Phase in Mais in Verbindung gebracht wird, aber keine bekannte Funktion bei der Regulierung von abiotischem Stress hat. Die funktionelle Charakterisierung einer Reihe ausgewählter, durch Mehrfachstress induzierbarer A. hypochondriacus-Gene in Arabidopsis, Tabak und/oder Amaranth wird derzeit in unserem Labor durchgeführt.

Transkriptionsprofil in Stängeln

Der Vergleich der aus Stängeln gewonnenen cDNA-Bibliothek (S6) mit denjenigen, die aus Blättern gewonnen wurden, die biotischem und abiotischem Stress ausgesetzt waren (S2 bis S5), ermöglichte es, eine kleine Gruppe von Transkripten zu identifizieren, deren Expression ausschließlich in Stängeln nachgewiesen wurde. Bemerkenswerterweise war die Akkumulation mehrerer anderer Transkripte in Stängeln höher als in Blattgewebe von Amaranth-Pflanzen, die (a)biotischem Stress ausgesetzt waren (siehe zusätzliche Datei 8). Das beobachtete Transkriptprofil stimmte mit den Daten überein, die zuvor für transkriptomische Analysen von Stängeln in Arabidopsis thaliana berichtet wurden. Alle annotierten Transkripte wurden ähnlich wie in den oben genannten Studien in verschiedene Kategorien eingeteilt.

Die Biosynthese von Lignin und Kutikulumwachs wurde durch Gene repräsentiert, die für Proteine kodieren, die vermutlich an der Monolignol-Biosynthese beteiligt sind (z. B. Cytochrom-P450-Reduktasen, die für die Aktivität mehrerer wichtiger Cytochrom-P450-Enzyme des Phenylpropanoid-Wegs benötigt werden), den Monolignol-Transport (z. B. ABC-Transporter) und den kutikulären Lipidexport (z. B. ABC-Transporter-Familie des Weiß-Braun-Komplexes). Die bescheidene Anzahl der hochregulierten Ligninbiosynthesegene, die entdeckt wurden, hing wahrscheinlich mit der Verwendung junger Amaranth-Pflanzen für die Experimente zusammen, die noch keine aktive Lignifizierung durchlaufen.

Die Kategorie der kohlenhydrataktiven Enzyme war stark vertreten. Dies war nicht überraschend, wenn man bedenkt, dass diese Proteine eine grundlegende Rolle bei der Biosynthese und Modifikation der Zellwand spielen und daher während der Stammentwicklung stark reguliert werden. Sie umfasste eine Reihe von Glykosyltransferasen und mehrere Glykosylhydrolasen (GH), die Familien mit Cellulase (GH9), β-1,3-Glucanase (GH3), Xylanase (GH10), Xyloglucan-Endotransglucosylase-Hydrolase (GH16), Glucan-Endo-1,3-beta-D-Glucosidase (GH17), Invertase (GH31) und β-D-Galactosidase (GH35). Diese Enzyme sind für die Lockerung und Dehnung der Zellwand, die Bildung der sekundären Zellwände von Gefäßgeweben, die Hydrolyse des Xylan-Rückgrats, posttranslationale Modifikationen (wie Glykosylierungen) von Proteinen und die Mobilisierung von Energie in Form von Saccharose erforderlich. Ebenfalls nachgewiesen wurden Pektinmethylesterasen (PME), die an der Veränderung der physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften von Pektinen beteiligt sind. Die gleichzeitige Expression eines PME-Hemmers ist wahrscheinlich auf die Notwendigkeit zurückzuführen, die PME in jungen Amarantstängeln zu regulieren, um die mit der PME-Aktivität verbundene Wandversteifung zu vermeiden. Darüber hinaus wurde ein mutmaßliches β-Expansin-Protein nachgewiesen; diese Proteine modulieren die Interaktion zwischen Hemicellulosen und Cellulose vermutlich durch eine Unterbrechung ihrer gemeinsamen Wasserstoffbrückenbindungen.

In der Gruppe der extrazellulären Oxido-Reduktasen wurden zwei Peroxidasen gefunden, die zu den Peroxidase-Familien 25 bzw. 64 gehören. Es wurde festgestellt, dass Peroxidasen in mäßigen bis hohen Konzentrationen in sich entwickelnden Stängeln exprimiert werden, wo sie vermutlich die Dehnbarkeit der Zellwand aufgrund ihrer Rolle bei der Bildung kovalenter Verbindungen zwischen Pektinresten, hydroxyprolinreichen Proteinen wie Extensinen und Ligninvorläufern verringern. Es wurde ein Gen identifiziert, das für eine Multikupferoxidase der SKS-Familie (SKS5) kodiert. Die Funktion dieser Proteine bei der Stängelentwicklung ist nicht genau bekannt, obwohl kürzlich festgestellt wurde, dass die Expression von SKS5 in metallüberakkumulierenden Ökotypen von Thlaspi caerulescens hochreguliert ist. Eine weitere Oxido-Reduktase, die in Amaranth-Stängeln identifiziert wurde, war ein 2-OG-Fe(II)-Oxygenase-Protein mit unbekannter Funktion, das kürzlich mit Abwehrmechanismen gegen Pilzinfektionen in Arabidopsis in Verbindung gebracht wurde.

Es wurden mehrere Gene identifiziert, die für Proteine mit mutmaßlichen Interaktionsdomänen mit Polysacchariden und/oder anderen Proteinen kodieren. Viele der in dieser Kategorie klassifizierten Gene sind Kinasen, Peptidrezeptoren und rezeptorähnliche Kinasen, die Entwicklungsprozesse in Pflanzen regulieren, wie der CLAVATA1-ähnliche Rezeptor , CLAVATA3/ESR-verwandter Rezeptor , Abnormal Leaf Shape 2 rezeptorähnliche Kinase , Leucin-reiche Repeat-Rezeptor-ähnliche Kinase RLK7 und LRR XI-23 Kinase . Eine Reihe von hydroxiprolinreichen (Glyko-)Proteinen, bei denen es sich höchstwahrscheinlich um Arabinogalactan-Proteine (AGPs), Strukturproteine (z. B. Extensine, prolinreiche Proteine, PRPs) und eine verwandte Prolyl-4-Hydroxylase (katalytische Alpha-2-Untereinheit) handelt, die für die Hydroxylierung von Prolinresten benötigt wird, wurden ebenfalls in hohem Maße in Stängeln exprimiert. Zahlreiche Rollen für AGPs in der Pflanzenentwicklung wurden durch ihren Einfluss auf die Bestimmung des Zellschicksals, die somatische Embryogenese und die Zellproliferation vorgeschlagen. Außerdem wurde angenommen, dass AGPs Signalmoleküle sind und mit pektischen Polysacchariden assoziieren, während Extensine, PRPs und andere (z. B. glycinreiche Proteine) nachweislich in bestimmten Zelltypen einschließlich Xylem- und Phloemgewebe exprimiert werden.

Ebenfalls vorhanden waren Gene, die für eine Rhomboid-ähnliche 2-Endopeptidase und zwei Proteine mit Inhibitor-Aktivität kodieren: ein Lipid-Transferprotein/Trypsin-alpha-Amylase-Inhibitor und ein Cystein-Proteinase-Inhibitor. Darüber hinaus wurden Transkripte für ein F-Box-Protein (SKIP2) und eine 26S-Proteasom-Nicht-ATPase-Regulationsuntereinheit nachgewiesen, von denen bekannt ist, dass sie am gezielten Abbau von Proteinen beteiligt sind, der als Reaktion auf verschiedene Stimuli während des Wachstums und/oder unter verschiedenen Stressbedingungen ausgelöst wird. Es wurde vermutet, dass die Proteinaseaktivität und ihre Modulation durch Proteinaseinhibitoren für die Verarbeitung und/oder den Umsatz von Zellwandproteinen, die Erzeugung von Peptidsignalen, den programmierten Zelltod und/oder das Gleichgewicht der Zellexpansions- und -proliferationsraten notwendig ist, die zusammengenommen für eine ordnungsgemäße Stammentwicklung erforderlich sind.

In der Kategorie der verschiedenen Proteine wurden Gene gefunden, die für Proteine kodieren, die am Lipidstoffwechsel beteiligt sind (GDSL-Lipasen und eine mutmaßliche Glycerophosphoryldiester-Phosphodiesterase), von denen angenommen wird, dass sie für die Stammentwicklung wichtig sind, ein kupferbindendes Plantacyanin (ARPN), von dem angenommen wird, dass es Oxidationsreduktionsprozesse in den Zellwänden reguliert, mehrere Proteine, von denen bekannt ist, dass sie für die Erhaltung der Stammzellen im Sprossapikalmeristem erforderlich sind (Histon H2A; Aurora 2 Histon-Kinase), Metalltoleranz (z.z. B. Selenocystein-Methyltransferase ) und Komponenten des Zytoskeletts, die höchstwahrscheinlich an der Zellteilung und -streckung beteiligt sind. Die Entdeckung eines Transkripts, das für die katalytische LigB-Untereinheit einer aromatischen ringöffnenden Dioxygenase-Familie (d. h. eine mutmaßliche Dopa-Dioxygenase), dem wichtigsten Enzym der Betacyanin-Biosynthese, und für biosynthetisch verwandte Glykosyltransferasen (GTs) (z. B. GT aus Phytolacca Americana und eine UDP-GT) kodiert, stand im Einklang mit dem stark pigmentierten Phänotyp des Stammgewebes, das zur Erzeugung der sequenzierten cDNA-Bibliothek verwendet wurde. Die Bestimmung der Struktur und Regulierung pigmentbezogener Gene, ihrer gewebe- und stressbedingten Expressionsmuster und ihrer wahrscheinlichen Rolle bei der Verteidigung gegen Insektenherbivorie in Korn-Amaranth wird nun in unserem Labor aktiv verfolgt. Es wurden auch mehrere TFs entdeckt. In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht gehörten die meisten TFs, die im Stängelgewebe von Amaranth stark exprimiert wurden, zur MYB-, AP2-EREBP-, GRAS-, bHLH-Domänen- und Homeodomänen-Familie (z. B. WOX4). TFs in Stängeln wurden auf verschiedene Weise mit der Regulierung der Biogenese und Differenzierung von Gefäßgewebe, der Expression von Phenylpropanoid-Genen und der Faserentwicklung in Verbindung gebracht. Schließlich wurde in den Stängeln von A. hypochondriacus eine hohe Expression mehrerer Gene festgestellt, die mit abiotischem Stress und der Verteidigung zusammenhängen. Das Vorhandensein hoch exprimierter Gene, die mit der Verteidigung zusammenhängen, stimmt mit einem kürzlich erschienenen Bericht überein, der zeigt, dass Gene, die mit der Verteidigung und den Schutzfunktionen von Pflanzen zu tun haben, in den sich entwickelnden Stämmen von Populus trichocarpa dominieren. In dieser Hinsicht spricht das gleichzeitige Vorhandensein einer mutmaßlichen Jasmonat-o-Methyl-Transferase und eines CXE-Carboxylesterase-Gens, das für ein Protein kodiert, das vermutlich Methyljasmonat (MeJA) als sein Substrat (zusätzlich zu Methylsalicylat und Indol-3-Acetat) in Actinidia arguta identifizieren kann, für eine mögliche Rolle von MeJA bei der Signalübertragung sowohl innerhalb als auch zwischen Amaranth-Pflanzen während biotischem und/oder abiotischem Stress. Zu den anderen interessanten Genen, die in Amaranth-Stängeln identifiziert wurden und denen kürzlich eine aktive Rolle bei der Pathogenabwehr zugeschrieben wurde, gehören die Gene, die für eine Epoxidhydrolase 2 bzw. ein VPE-1B kodieren. Man nimmt an, dass die Rolle der Epoxidhydrolase bei der Abwehr mit ihrer Beteiligung an der Entgiftung, der Signalübertragung und/oder dem Metabolismus antimikrobieller Verbindungen zusammenhängt, während die Bedeutung von VPE auf ihre Beteiligung an der durch Auslöser ausgelösten Immunität in Verbindung mit der kombinierten Induktion einer überempfindlichen Reaktion (HR) und der Schließung der Stomata zurückzuführen ist. Wie bereits erwähnt, wurde die Expression von VPE auch mit Reaktionen auf abiotischen Stress in Verbindung gebracht.