Variationen im Calvin-Benson-Zyklus: Selektionsdruck und Optimierung?

Der Calvin-Benson-Zyklus ist die Grundlage der Kohlenstofffixierung in allen photosynthetischen Organismen. Es ist jedoch relativ wenig darüber bekannt, inwieweit seine Funktionsweise zwischen den Arten variiert. Mithilfe eines Metaboliten-Profiling-Ansatzes entdeckten wir Unterschiede in den Konzentrationen wichtiger Zwischenprodukte des Calvin-Benson-Zyklus bei C3- und C4-Arten. Diese Unterschiede in den Metabolitenpools wurden sowohl zwischen C3-Arten als auch zwischen C3- und C4-Pflanzen beobachtet. Diese Arbeit wirft die interessante Möglichkeit auf, dass unterschiedlicher Selektionsdruck auf die Komponenten des Calvin-Benson-Zyklus zu seiner unabhängigen Optimierung zwischen den Arten geführt hat.

Im Jahr 1954 veröffentlichten Melvin Calvin, Andrew Benson und James Bassham den Stoffwechselweg, der zur Fixierung von atmosphärischem CO2 verwendet wird – den Calvin-Benson-Zyklus (Bassham et al., 1954). Ihre grundlegenden Entdeckungen basierten auf der Fütterung der Alge Chlorella mit 14C-markiertem CO2 und der Verfolgung der Markierung der Metaboliten im Laufe der Zeit (Bassham et al., 1954; Sharkey 2018). Sie entdeckten, dass der Zyklus aus drei Phasen besteht: Zunächst bindet das Enzym Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco) CO2 unter Verwendung von Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) als Akzeptor und produziert zwei 3-Kohlenstoff-Moleküle, 3-Posphoglycerat (3-PGA). Zweitens werden ATP und NADPH, die während der photosynthetischen Elektronentransportkette (die lichtabhängigen Reaktionen der Photosynthese) erzeugt werden, zur Phosphorylierung und anschließenden Reduktion von 3-PGA zu Triosephosphat (Triose-P) verwendet. Drittens wird der CO2-Akzeptor RuBP durch eine Reihe von Reaktionen regeneriert (Kasten 1). Die meisten Enzyme, die an diesem Zyklus beteiligt sind, wurden früher oder kurz danach entdeckt (Horecker et al. 1951; Racker et al., 1953; Mayoudan et al., 1957). Seitdem geht man allgemein davon aus, dass der Calvin-Benson-Zyklus bei den verschiedenen Pflanzenarten sehr konserviert ist.

Kasten 1.

Der Calvin-Benson-Zyklus

Der Calvin-Benson-Zyklus besteht aus drei Phasen: (1) Kohlenstofffixierung, (2) Reduktion und (3) Regeneration des CO2-Akzeptors.

Die Carboxylierung erfolgt über Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase (Rubisco), die CO2 unter Verwendung von Ribulose-1,5-Bisphosphat (RuBP) als Akzeptor fixiert und dabei zwei 3-Kohlenstoff-Moleküle 3-Phosphoglycerat (3-PGA) produziert. 3-PGA wird anschließend von der Phosphoglyceratkinase (PGK) phosphoryliert und in der Reduktionsphase von der Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) zu Triosephosphat (Triose-P) reduziert. Der Zyklus verbraucht 3 ATP und 2 NADPH pro Molekül gebundenen CO2. Triose-P kann aus dem Chloroplasten transportiert werden, um im Cytosol Saccharose zu erzeugen. Die Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase (FBP ald) kann Triose-P in Fructose-6-phosphat (F6P) umwandeln, das Zwischenprodukt zur Herstellung von Stärke. Außerdem kann Triose-P in einer Reihe von Regenerationsreaktionen zur Bindung weiterer CO2-Moleküle in RuBP umgewandelt werden.

Abkürzungen: Fructose-1,6-Bisphosphat (FBP), Fructose-1,6-Bisphosphatase (FBPase), Erythrose-4-Phosphat (E4P), Sedoheptulose-1,7-Bisphosphat-Aldolase (SBP ald), Sedoheptulose-1,7-Bisphosphat (SBP), Sedoheptulose-1,7-Bisphosphatase (SBPase), Sedoheptulose-7-phosphat (S7P), Transketolase (TK), Ribose-5-phosphat (R5P), Xylulose-5-phosphat (Xu5P), Ribose-5-phosphat-Isomerase (RPI), Ribulose-5-phosphat-Epimerase (RPE), Ribulose-5-phosphat (Ru5P), Phosphoribulokinase (PRK). Enzyme, die irreversible Reaktionen katalysieren, sind durch einen dicken fetten Pfeil hervorgehoben (d.h. Rubisco, FBPase, SBPase und PRK).

In der überwiegenden Mehrheit der Landpflanzen wird der Calvin-Benson-Zyklus zusammen mit den lichtabhängigen Reaktionen der Photosynthese hauptsächlich in den Mesophyllzellen der Blätter durchgeführt. Rubisco kann jedoch schlecht zwischen CO2 und O2 unterscheiden (Bowes et al., 1971), und die Fixierung eines O2-Moleküls anstelle von CO2 führt zur Photorespiration – einem energetisch teuren Bergungsweg zur Wiedergewinnung von RuBP. Nachdem die atmosphärische CO2-Konzentration vor 2,3 Milliarden Jahren drastisch gesunken war (Bekker et al., 2004), entwickelten sich zwei Mechanismen zur Konzentration von Kohlenstoff, die die Menge der Photorespiration begrenzten. Diese Modifikationen des grundlegenden photosynthetischen Prozesses, die C4-Photosynthese und der Crassulaceen-Säurestoffwechsel (CAM), sind jeweils mehrfach entstanden (Sage et al., 2011). Bei der C4-Photosynthese ist die Photosynthese räumlich getrennt, so dass die Komponenten sowohl der lichtabhängigen Reaktionen als auch des Calvin-Benson-Zyklus in Mesophyll- und Bündelscheidenzellen stattfinden (Kasten 2). Trotz der Unterschiede im anatomischen Ort der Kohlenstofffixierung war bisher wenig darüber bekannt, wie sich die Funktionsweise des Calvin-Benson-Zyklus in C4- und C3-Pflanzen sowie zwischen C3-Pflanzen unterscheidet.

Kasten 2.

Der Mechanismus der Kohlenstoffkonzentration in C4-Pflanzen

Im Jahr 1966 entdeckten Hal Hatch und Roger Slack die C4-Photosynthese (Hatch und Slack, 1966), bei der ein Mechanismus der Kohlenstoffkonzentration zum regulären C3-Kohlenstofffixierungsweg hinzukommt. Sie wiesen mit Hilfe der 14C-Markierung nach, dass das CO2 in den Blättern des Zuckerrohrs zunächst in eine 4-Kohlenstoff-Säure und nicht wie bei den C3-Pflanzen in 3-Posphoglycerat (3-PGA) gebunden wird. C4-Pflanzen verwenden Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPC) als erstes kohlenstoffbindendes Enzym in den Mesophyllzellen. Die in den Mesophyllzellen produzierte 4-Kohlenstoffsäure (Malat oder Aspartat, je nach Art der C4-Photosynthese) gelangt dann in die Zellen der Bündelscheide, wo sie decarboxyliert und CO2 freigesetzt wird. Dieser Mechanismus der Kohlenstoffanreicherung ermöglicht es Rubisco, während des Calvin-Benson-Zyklus in den Zellen der Bündelscheide fast ausschließlich als Carboxylase zu wirken. Zusätzlich zu einer Neukonfiguration der bestehenden Stoffwechselenzyme erfordert der C4-Weg die Entwicklung einer spezialisierten Blattanatomie (Kranz-Anatomie), die eine Vergrößerung der Aderabstände und der Größe der Bündelscheidenzellen beinhaltet. Klassischerweise werden drei verschiedene Arten der C4-Photosynthese unterschieden, die nach dem primären Enzym benannt sind, das für die Decarboxylierungsreaktion in den Bündelscheidenzellen verantwortlich ist: NAD-ME, NADP-ME oder PEPCK-Typ. Abkürzungen: Kohlensäureanhydrase (CA), Oxalacetat (OA), NADP-abhängige Malatdehydrogenase (NADP-MDH), Malat (M), NADP-abhängiges Apfelsäureenzym (NADP-ME), Pyruvat (Pyr), Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase (PPDK), Phosphoenolpyruvat (PEP).

Variationen der Metaboliten des Calvin-Benson-Zyklus zwischen den Arten

Der Calvin-Benson-Zyklus ist zweifellos einer der kritischsten biochemischen Wege auf der Erde, da er der Weg der Kohlenstoffassimilation in Pflanzen ist – das Herz der Photosynthese. Aber läuft dieser Weg bei allen Pflanzenarten auf die gleiche Weise ab? Arrivault et al. (2019) erstellten ein Profil der Häufigkeit von Metaboliten des Calvin-Benson-Zyklus bei fünf C3-Pflanzen (darunter Arabidopsis und mehrere wichtige Nutzpflanzen wie Reis, Weizen und Maniok) und vier C4-Pflanzen (darunter Mais). Die gesamten Metaboliten wurden aus reifen Blättern extrahiert und mit Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie gekoppelt an Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) gemessen. Für eine zuverlässige Quantifizierung wurden die Proben mit isotopenmarkierten internen Metabolitenstandards versetzt; 3-PGA wurde enzymatisch quantifiziert. Die Metabolitenprofile der verschiedenen Pflanzenarten wurden mithilfe der Hauptkomponentenanalyse verglichen.

Auffallend ist, dass Arrivault et al. (2019) erhebliche Unterschiede in den Metabolitenprofilen der Zwischenprodukte des Calvin-Benson-Zyklus zwischen den fünf untersuchten C3-Arten feststellten. Zu den Zwischenprodukten, die am stärksten variierten, gehörten die absoluten Gehalte von 3-PGA, Triose-P, Ribulose-5-Phosphat (Ru5P) und Xylulose-5-Phosphat (Xu5P). Die relativen Gehalte an RuBP im Vergleich zu den Gehalten an Zwischenprodukten, die an der RuBP-Regeneration beteiligt sind, waren von Art zu Art unterschiedlich. Darüber hinaus wiesen die Autoren eine Variabilität der relativen Gehalte von Metabolitenpaaren wie Fructose-1,6-Bisphosphat (FBP) und Fructose-6-Phosphat (F6P), die durch die irreversible Reaktion der FBPase miteinander verbunden sind, und des Metabolitenpaares Sedoheptulose-1,7-Bisphosphat (SBP) und Sedoheptulose-7-Phosphat (S7P), die durch die SBPase irreversibel umgewandelt werden, nach. In den meisten Fällen trennten sich die fünf C3-Arten in der Hauptkomponentenanalyse deutlich voneinander. Das Ausmaß der Trennung hing davon ab, ob die Daten auf das Frischgewicht, den Chlorophyllgehalt oder den Proteingehalt normiert wurden. Die Unterschiede bei diesen Zwischenstufen innerhalb der fünf C3-Arten deuten auf Unterschiede in der Art und Weise hin, wie Pflanzen denselben Kohlenstoff-Fixierungspfad betreiben. Diese Informationen haben Konsequenzen für Strategien zur Verbesserung der Photosynthese. Beispielsweise kann SBPase die Photosyntheserate begrenzen (Zhu et al., 2007) und eine Überexpression kann die photosynthetische Effizienz erhöhen (Lefebvre et al., 2005; Feng et al. 2007; Ding et al., 2016; Driever et al., 2017). Die Veränderung der Aktivität eines einzelnen Enzyms im Calvin-Benson-Zyklus kann sich also auf die Photosyntheserate und damit auf Biomasse und Ertrag auswirken. Es ist jedoch bekannt, dass die Wirksamkeit dieses Ansatzes von Art zu Art variiert. Die von Arrivault et al. (2019) berichteten Unterschiede in den Konzentrationen der SBP- und S7P-Metaboliten zwischen C3-Arten sind daher wichtig und könnten Aufschluss über die unterschiedliche Reaktion der Photosynthese auf eine Erhöhung der SBPase-Mengen geben.

Da der Mechanismus der Kohlenstoffkonzentration von C4-Pflanzen die Photorespiration begrenzt, war es vielleicht weniger überraschend, dass das erste Produkt der Photorespiration, 2-Phosphoglykolat (2-PG), bei C4-Arten weniger häufig vorkam als bei C3-Arten. Außerdem wiesen C4-Pflanzen niedrigere RuBP-Konzentrationen als C3-Pflanzen auf, was mit ihren geringeren Investitionen in Rubisco übereinstimmt. Doch selbst wenn die 2-PG- und RuBP-Konzentrationen aus dem Datensatz herausgenommen wurden, trennten sich die C3- und C4-Metaboliten-Konzentrationen fast immer in der Hauptkomponentenanalyse. Diese Unterschiede waren konsistent, unabhängig davon, ob die Daten auf das Frischgewicht, den Chlorophyllgehalt oder den Proteingehalt normiert wurden, und so deuten die Veränderungen darauf hin, dass die Enzyme, die für die Erzeugung der Metaboliten verantwortlich sind, die Katalyse bei den verschiedenen Arten mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durchführen. Die Autoren prägen den Begriff „Betriebsmodus“ des Calvin-Benson-Zyklus, um diese Unterschiede zu beschreiben, d. h. der Zyklus funktioniert bei den verschiedenen Arten unterschiedlich, obwohl dieselben Enzyme beteiligt sind, was zu den beobachteten Veränderungen in den relativen Mengen der Zwischenprodukte führt. Sie schlagen daher vor, dass die Unterschiede im Calvin-Benson-Zyklus zwischen C3- und C4-Pflanzen über eine einfache räumliche Verlagerung in die Bündelscheidezellen der letzteren hinausgehen und eine Anpassung der Funktionsweise des Zyklus beinhalten.

Zukunftsperspektiven

Die Feststellung, dass die Funktionsweise des Calvin-Benson-Zyklus variieren kann, ist interessant, insbesondere wenn man bedenkt, dass die Struktur des Stoffwechsels (in Bezug auf die beteiligten Enzyme und ihre Reaktionsfolge innerhalb des Zyklus) in hohem Maße konserviert ist. Im Laufe der Jahrmillionen seit dem ersten Auftreten des Zyklus hat sich jedoch das Verhältnis von O2 zu CO2 in der Atmosphäre drastisch verändert. Es wird angenommen, dass diese Veränderungen dazu beigetragen haben, dass einige Pflanzenarten Mechanismen zur Konzentration von Kohlenstoff entwickelt haben. Die Autoren schlagen nun vor, dass niedrige CO2-Gehalte in Kombination mit spezifischen Umweltbedingungen zur Entwicklung verschiedener Betriebsmodi des Calvin-Benson-Zyklus geführt haben könnten. Die beobachteten Unterschiede in den Metabolitenprofilen könnten daher auf einen unterschiedlichen Selektionsdruck bei der Regulierung des Calvin-Benson-Zyklus in verschiedenen Pflanzenstämmen zurückzuführen sein. Der von den Autoren für die Analyse der Zwischenprodukte des Calvin-Benson-Zyklus verwendete Ansatz könnte nun auf weitere Arten angewandt werden, und dies wäre besonders interessant, wenn diese ein breiteres Spektrum von Pflanzenfamilien in unterschiedlichen Umgebungen abdecken würden. Dies könnte Aufschluss darüber geben, ob die Variation streng nach phylogenetischen Taxa oder spezifischen Umgebungen, an die sich die Pflanzen angepasst haben, erfolgt.

Auch die in Arrivault et al. analysierten C4-Pflanzen betreiben alle den NADP-ME-Typ der C4-Photosynthese. Ein vielversprechender Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen wäre daher, zu erforschen, ob ähnliche Veränderungen bei den Zwischenprodukten des Calvin-Benson-Zyklus bei allen drei Arten des C4-Stoffwechsels zu beobachten sind oder ob sie spezifisch für den NADP-ME-Typ sind.

Diese Arbeit ist ein hervorragender Ausgangspunkt, um herauszufinden, wie diese verschiedenen Modi des Calvin-Benson-Zyklus auf molekularer Ebene gesteuert werden. Während die Erstellung von Metabolitenprofilen einen unvoreingenommenen Ansatz zur Bewertung der Unterschiede in den Konzentrationen von Zwischenprodukten zwischen verschiedenen Arten ermöglicht, müssen die Ursachen für diese Unterschiede noch ermittelt werden. Die Unterschiede zwischen den Arten könnten auf Unterschiede in der Genexpression und den daraus resultierenden Proteinaktivitäten, auf Variationen in der Aminosäuresequenz, die sich auf die Kinetik auswirken, oder auf die posttranslationale Regulierung der Enzyme zurückzuführen sein. Bemerkenswert ist, dass fast alle Enzyme des Calvin-Benson-Zyklus zumindest einer Form der Redox-Regulierung unterliegen, meist über das Thioredoxin (TRX)/Fferredoxin (Fd)-System (Buchanan und Palmer, 2005; Michelet et al. 2013). Die Integration dieser Transkript-, Proteinhäufigkeits- und Enzymaktivitätsdaten in die Metabolitenwerte könnte die molekulare Grundlage der Variationen aufdecken. Darüber hinaus können die beobachteten Schwankungen in den Metabolitenpools auch mit dem Bedarf an bestimmten Zwischenprodukten zusammenhängen, insbesondere an solchen, die dem Calvin-Benson-Zyklus entzogen werden. Beispielsweise kann der Fluss durch den Zyklus durch Ausgänge beeinflusst werden, die die Synthese von Stärke (über F6P), Saccharose und Isoprenoiden (über Triose-P), Aminosäuren über den Shikimatweg (über E4P) sowie Thiamin und Nukleotide (über R5P) ermöglichen (Raines, 2011).

Arrivault et al. (2019) berichten über interessante Variationen in der Funktionsweise der Komponenten des Calvin-Benson-Zyklus in verschiedenen Pflanzenarten. Dies wird sicherlich zu weiteren Studien darüber führen, wie Pflanzen diesen grundlegenden und uralten Weg der Kohlenstofffixierung an verschiedene Umgebungen angepasst haben.