Möchten Sie Blutproben für Ihre translationale Forschung nutzen? Vielleicht interessieren Sie sich für metastasierenden Brustkrebs oder nicht-kleinzelligen Lungenkrebs. Oder vielleicht haben Sie aufgrund der Herausforderungen und Beschränkungen bei Proben von soliden Tumoren den Eindruck, dass es an der Zeit ist?
Was nun?
Lassen Sie uns einen genaueren Blick auf die DNA-Ausbeute und die Realität der Arbeit mit zellfreier DNA aus Plasma werfen. Zellfreie DNA (oder cfDNA) bezieht sich auf die gesamte nicht eingekapselte DNA im Blutstrom. Ein Teil dieser zellfreien DNA stammt von einem Tumorklon und wird als zirkulierende Tumor-DNA (oder ctDNA) bezeichnet. cfDNA sind Nukleinsäurefragmente, die während der Apoptose oder Nekrose in den Blutkreislauf gelangen. Normalerweise werden diese Fragmente von Makrophagen aufgeräumt, aber wir glauben, dass die Überproduktion von Zellen bei Krebs mehr cfDNA zurücklässt. Diese Fragmente sind im Durchschnitt etwa 170 Basen lang, haben eine Halbwertszeit von etwa zwei Stunden und sind sowohl in frühen als auch in späten Krankheitsstadien bei vielen verbreiteten Tumoren, einschließlich nicht-kleinzelliger Lungen- und Brustkrebs, vorhanden. Die cfDNA-Konzentration schwankt jedoch stark und liegt zwischen 1 und 100.000 Fragmenten pro Milliliter Plasma.
Wenn Sie sich schon eine Weile mit der Sequenzierung der nächsten Generation beschäftigen, werden Sie sich für Sensitivität und Spezifität interessieren. Wir haben eine hohe Sensitivität und Spezifität für Varianten mit einer Häufigkeit von mehr als einem Prozent bei 20 Nanogramm Input-DNA und mehr als fünf Prozent bei 5 Nanogramm nachgewiesen. In unserem Video über cfDNA-Assays erfahren Sie mehr darüber, wie man das macht. Vielleicht haben Sie schon von der Verwendung von cfDNA für Analysen mit einer Nachweisgrenze von null Prozent gehört. Es gibt zwar die Technologie, um 0,01 % zu erreichen (z. B. digitale Tröpfchen), aber es gibt eine biologische Grenze, über die wir sprechen müssen.
Aus einer 10-ml-Blutprobe erhalten wir mit dem MagMAX Cell-Free DNA Isolation Kit von Applied Biosystems routinemäßig etwa 20 Nanogramm cfDNA, d. h. etwa 6 verwertbare Moleküle für die Analyse. Eine kurze Rechnung zeigt uns, dass wir bei einer Nachweisgrenze von 1 % etwa 25 Moleküle erwarten können. Bei 0,1 % sind nur 2-3 Moleküle zu erwarten. Das bedeutet, dass unter 0,1 % möglicherweise gar keine Moleküle für die Analyse vorhanden sind. Bedenken Sie auch, dass die cfDNA-Konzentrationen stark schwanken. Sie können in kritischen Stadien wie dem frühen Wiederauftreten oder der Entwicklung von Resistenzen, auf die sich viele Forscher jetzt konzentrieren, sehr niedrig sein. Für die erfolgreiche Isolierung von 20 Nanogramm DNA aus Blutplasma stehen je nach Durchsatzbedarf sowohl manuelle als auch automatisierte Methoden zur Verfügung.
Die DNA in der Hand, diktiert Ihre Forschung, welchen Weg Sie an diesem Punkt einschlagen. Für Studien zur Überwachung des Wiederauftretens von Krankheiten könnten Sie die digitale PCR wählen. Für die Forschung im Bereich der Therapieauswahl könnte ein Next-Generation-Sequencing-Assay die bessere Wahl sein. Wo auch immer Ihre Flüssigbiopsie-Forschung Sie hinführt, wir können Ihnen mit Komplettlösungen für die cfDNA-Analyse helfen, von einigen wenigen Targets bis hin zu Multigen-Assays.
Ich hoffe, wir haben Ihnen einige Denkanstöße gegeben, wenn Sie die Verwendung zellfreier DNA in Ihrem Labor in Betracht ziehen. Aber ich bin mir sicher, dass Sie einige Fragen haben werden. Stellen Sie Ihre Fragen unter thermofisher.com/ask und abonnieren Sie unseren Kanal, um weitere Videos wie dieses zu sehen. Und denken Sie daran: Im Zweifelsfall einfach Seq It Out!