Actividad bactericida de los extractos de té verde: la importancia de las nanopartículas que contienen catequina

Pruebas de bioactividad- Actividad antiestreptocócica

Se estudiaron las propiedades antibacterianas de tres tés verdes diferentes y sus extractos y partículas obtenidas a 5000 rpm y 10000 rpm y 20000 rpm contra el patógeno dental, S.mutans. Con el fin de optimizar la concentración del extracto de té verde para otros experimentos, se probaron seis concentraciones diferentes (0 μL, 50 μL, 100 μL, 200 μL, 300 μL y 500 μL) de GT-0 (sin eliminar la partícula) y 5K-S de GT 1, GT 2 y GT 3 contra S. mutans. La figura 2 muestra los resultados de este estudio. Como se observa en la Fig. 2(a), el método espectrofotométrico reveló que en el caso de GT-0 y 5K-S con respecto a los tres tés verdes, la actividad antiestreptocócica aumentaba con el incremento de la concentración. Se observó que las concentraciones de 300 μL mostraban una actividad antimicrobiana óptima y, por tanto, se distinguieron como la concentración optimizada para todos los demás experimentos de este estudio. Así, a partir de ahora, todos los experimentos se realizaron utilizando concentraciones de 300 μL de las variables del té verde. La figura 2(b) muestra los resultados obtenidos mediante la evaluación antimicrobiana utilizando el método de recuento total de viables. Los resultados del recuento en placa se correlacionaron con los observados en el caso de las mediciones de turbidez basadas en el espectrofotómetro. Otra observación interesante observada a partir de estos resultados es la mejora marginal en la actividad antimicrobiana observada en la eliminación de las partículas a 5000 rpm (5K-S) en comparación con GT-0. En comparación con el GT 1-0, el GT 1-5K-S mostró una mayor actividad antibacteriana, al igual que el GT 2 y el GT 3. Además, se observó que el GT 3 presentaba la mayor actividad antibacteriana y el GT 1 la menor actividad antibacteriana.

Dado que la eliminación de las partículas del té verde mostró cambios en la bioactividad del extracto de té verde, se propuso hacer una investigación detallada sobre el estudio de este efecto. Se llevó a cabo un proceso sistemático de centrifugación en tres pasos, a 5.000 rpm, 10.000 rpm y 20.000 rpm, para separar las partículas más grandes, las más pequeñas y las aún más pequeñas del extracto. Se estudió la interacción del extracto con las partículas grandes (5K-S), pequeñas (10K-S) y finas (20K-S) y las partículas (5K-P, 10K-P y 20K-P) con S. mutans y sus actividades antibacterianas individuales. La figura 3 muestra los resultados de este estudio. Como se observa en la Fig. 3(a-1,a-2), tanto el método basado en la turbidez como el método de recuento en placa, confirmaron que, con respecto al GT 1, la eliminación del 5K-P dio lugar a una mayor actividad antibacteriana (mejora marginal) del extracto (5K-S) en comparación con el GT 1-0. La eliminación de 10K-P no dio lugar a ninguna otra mejora y 10K-S resultó ser generalmente similar a la actividad de 5K-S. Sin embargo, la eliminación de 20K-P dio lugar a una clara pérdida de actividad antimicrobiana en 20K-S. Esta observación fue evidente en el caso del GT 2 (Fig. 3(b-1,b-2)) y del GT 3 (Fig. 3(c-1,c-2)). Aunque la tendencia tuvo diversos grados de variación del GT 1 al GT 2 y al GT 3, pero el hecho de que la eliminación de las partículas grandes de té verde del extracto aumentó marginalmente la propiedad antibacteriana del extracto de té verde y que la erradicación de las fracciones más pequeñas de partículas de té verde del extracto condujo a una clara disminución de la actividad antibacteriana del té verde sigue siendo incuestionable.

Sin embargo, es importante destacar aquí que ni las partículas 5K-P, ni las 10K-P ni las 20K-P mostraron una actividad antibacteriana independiente superior a la de los extractos. Las partículas 5K-P mostraron una actividad antibacteriana nula, las 10K-P mostraron un grado limitado de actividad antibacteriana, mientras que las 20K-P mostraron cierta actividad en medio de las otras dos contrapartes.

Pruebas en tiempo real de la bacteria dental

Para evaluar esta variación en la bioactividad de los extractos de té verde deshaciéndose de las partículas de té verde en sistemas en tiempo real, los extractos se enfrentaron a muestras reales de biofilm dental de cinco voluntarios humanos diferentes. Se probaron los GT 0, 5K-S y 20K-S de GT 1, GT 2 y GT 3. La figura 4 muestra los recuentos totales viables según el método de recuento en placa, indicando las bacterias que sobrevivieron a la interacción con el té verde. Es interesante observar que, a pesar de la complejidad de la muestra, en comparación con el GT 0, el 5K-S mostró una mayor actividad antibacteriana, mientras que el 20K-S mostró una menor actividad antibacteriana con respecto a los tres tés verdes.

La imagen de fluorescencia de las células utilizando naranja de acridina, ayuda a la visualización y diferenciación entre células vivas/muertas después del tratamiento. Tomamos imágenes de las muestras de biofilm dental de los cinco voluntarios antes y después de la interacción con GT 0, 5K-S y 20K-S y el control. La figura 5 muestra los resultados de fluorescencia que muestran el efecto de las variables del té verde en el voluntario 1 (A), el voluntario 2 (B), el voluntario 3 (C), el voluntario 4 (D) y el voluntario 5 (E). Como se observa en la Fig. 5(a), las imágenes de control en A, B,C,D y E muestran una fluorescencia predominantemente naranja que indica la presencia de bacterias dentales vivas en proceso de metabolización. Como se observa en la imagen, la biopelícula desprendida de los dientes conservó su identidad de biopelícula y aparece como tapetes microbianos en el caso del control. El tratamiento con GT 0 produjo el esperado efecto de eliminación del té verde (Fig. 5(b)) en el caso de todos los voluntarios. Predominaron las zonas de fluorescencia verde (células muertas), coexistiendo zonas de fluorescencia naranja en medio. El panel (c) muestra los resultados del sobrenadante 5K-S del GT 3, en el que se eliminaron las partículas de té verde más grandes del extracto. Como se observa en las imágenes microscópicas de fluorescencia, no se observó ninguna fluorescencia naranja y sí una fluorescencia verde completa que indica la aniquilación total de las bacterias/biopelículas dentales. También fue interesante observar que ya no se observaron parches o alfombras de biofilm, las alfombras de biofilm se desintegraron y todo lo que se ve son grupos de células dispersas en todas las muestras de prueba (A(c), B(c).C(c).D(c) y E(c). Por último, la Fig. 5(d) muestra los resultados de la interacción 20K-S, en la que se aprecia un descenso significativo en el efecto de eliminación del extracto de té verde. La aparición de células bacterianas vivas fluorescentes de color naranja indica una disminución de la actividad antimicrobiana del extracto al eliminar los nano componentes del té verde. Aunque también se observan células muertas fluorescentes de color verde, la proporción entre células vivas y muertas parecía alterada. Estos resultados confirmaron la tendencia comunicada mediante el método espectrofotométrico y el método de recuento en placa de la actividad antimicrobiana de los diversos componentes del té verde de prueba.

En la Fig. 6 (a-c) se observa la MEF de las bacterias dentales de control y de las que interactúan con el 5K-S. Como se observa en la figura, el control (Fig. 6(a)) muestra una biopelícula bien desarrollada (Voluntario 4), mientras que la interacción del GT 0 (Fig. 6(b)) del GT 3 y del 5K-S (Fig. 6(c)) provocó daños en las células y en la biopelícula, como indican los restos celulares. Las imágenes captadas mediante CLSM (d) muestran que una gran mayoría de las bacterias dentales de los cinco voluntarios fueron eliminadas por GT 3 (5K-S). GT 3-GT 0 y 5K-S resultaron ser los más prometedores contra las bacterias dentales de todos los voluntarios.

Caracterización del extracto y de las partículas

Con los resultados de los ensayos de bioactividad basados en la actividad antibacteriana de los componentes del té verde que muestran que la presencia y la ausencia de las partículas de té verde alteran de hecho la actividad del extracto, es necesario que los extractos GT 0, 5K-S, 10K-S y 20K-S y luego las partículas 5K-P, 10K-P y 20K-P de los tres tés verdes se caractericen de forma elaborada.

Caracterización bioquímica

La actividad antibacteriana se rige generalmente por los fenoles totales, los flavonoides y la capacidad antioxidante de un extracto. Todos estos parámetros fueron estudiados y comparados entre los extractos y las partículas empleadas en este estudio. La figura 7(a) muestra los resultados obtenidos en el caso del GT 1, en el caso de los flavonoides, como se observa en el gráfico, no se observó mucha diferencia en el contenido de flavonoides entre los extractos GT 0, 5K-S, 10K-S y 20K-S, el GT 0 parecía mostrar un aumento marginal en comparación con el resto. Sin embargo, en el caso de las partículas de té verde, el 5K-P registró el mayor contenido de flavonoides, y el 10K-P y el 20K-P le siguieron en rangos de flavonoides similares a los encontrados en los extractos. En el caso del GT 2 Fig. 7(b) y del GT 3 Fig. 7(c) el contenido de flavanoides fue diferente, los extractos 5K-S y 10K-S mostraron los contenidos más altos de flavanoides en comparación con el GT 0. Las partículas 5K-P y 10K-P mostraron contenidos muy bajos de flavanoides. Las excepciones fueron que los extractos 20K-S mostraron menos flavonoides en comparación con los otros extractos y las partículas 20K-P mostraron mayores flavonoides en comparación con las otras partículas.

Respecto a los fenoles totales, en el GT 1 el más alto se encontró en el GT 0, mientras que el resto mostró valores menores. Sin embargo, en el caso de los GT 2 y 3 se observó de nuevo una tendencia similar en el caso del contenido fenólico, donde todos los extractos mostraron contenidos fenólicos casi similares. Pero el 5K-P y el 10K-P mostraron el menor contenido fenólico en comparación con el 20K-P.

En términos de actividad antioxidante, los extractos del GT 1 (GT 0, 5K-S, 10K-S y 20K-S) mostraron una actividad antioxidante muy alta, mientras que el 5K-P y el 10K-P mostraron una actividad antioxidante seis veces menor. Sin embargo, es necesario mencionar aquí que los 20K-P mostraron una actividad antioxidante significativamente mayor en comparación con los 5K-P y 10K-P. En los GT 2 y 3 esta tendencia fue más pronunciada, ya que los 5K-S y 10K-S mostraron una mayor actividad antioxidante en comparación con el GT 0. Sin embargo, se observó una clara disminución de la actividad antioxidante en el caso de los 20K-S, con el correspondiente aumento de la actividad en los 20K-P de los GT 2 y 3. Hay que señalar que, entre los tres tés verdes estudiados, el GT 3 registró los valores más altos de estos compuestos bioactivos, seguido de cerca por el GT 2 y, por último, el GT 1 quedó significativamente por detrás. Esta tendencia está fuertemente correlacionada con la bioactividad antimicrobiana de los tés verdes, que fue en el orden de GT 3 > GT 2 > GT1.

Análisis FE-SEM

Las partículas 5K-P, 10K-P y 20K-P fueron visualizadas usando FE-SEM para sus detalles morfológicos y tamaños. La figura 8 muestra las morfologías 5K-P (a), 10K-P (b) y 20K-P (c) de las partículas del GT 1 (A), GT 2 (B) y GT 3 (C). En la mayoría de los casos se observaron morfologías irregulares sin forma definida. Como se observa en la Fig. 8, las partículas 5K-P en el caso del GT 1 y del GT 2 se observaron de tamaño macroscópico, que son las que vemos visiblemente en nuestra taza de té verde. La tabla 1 muestra sus tamaños, las partículas 5K-P del GT 2 (B) fueron las más grandes (50-80 μm), seguidas por las del GT 1(B(a)) que estaban en el rango de tamaño de 15-25 μm. Las partículas GT 3 5K-P eran relativamente más pequeñas en el rango de 6-30 μm (Fig. 8(C(a)). Como se observa en las micrografías, las partículas no tenían un tamaño fijo, lo que se espera de unas muestras comerciales tan crudas y no estandarizadas. Las partículas de 10K-P estaban en los rangos de tamaño microscópico de 4-10 μm en el caso del GT 1 (A(b)), el GT 2 era de 2-10 μm (Fig. 8B(b)) y el GT 3 en el rango de tamaño de 0,5-3 μm (C(b)). Las partículas de 20K-P eran más pequeñas de tamaño microscópico a nano, con las partículas del GT 1 en el régimen de 0,5-6 μm (A(c)), las partículas del GT 2 (B(c)) eran de 200 nm a 540 nm y las partículas del GT 3 (C(c)) eran las de menor tamaño existiendo en el régimen de tamaño de 50 nm-300 nm. Por lo tanto, como muestran estos resultados, se observó que las partículas de 20K-P que poseían componentes bioactivos mejorados y mostraban propiedades antioxidantes y antibacterianas existían en el régimen casi nano.

Espectrofotometría UV-Vis

La figura 9 muestra el espectro UV-Vis de los extractos y partículas caracterizados por su contenido en EGCG. Atomssa & Gotlap 201539 han informado de la absorbancia para la familia de las catequinas: EGCG muestra una absorbancia en el rango de 248-361 nm en agua con λmax a 273,6 nm; ECG 246- 363 nm λmax a 276,8 nm; el rango espectral de EGC en agua es de 254-378 nm y λmax a 269,6 nm y el de EC es de 252-328 nm con λmax a 278,4 nm. Como se observa en la Fig. 9(a) GT-1, sólo vemos el pico de absorción de EGCG a 273 nm. En términos de pico de EGCG no se observó ninguna diferencia dentro de los extractos (GT 0, 5K-S, 10K-S y 20K-S). Sin embargo, en el caso de las partículas de té verde se observó que las de 20K-P mostraron un aumento significativo de la intensidad del EGCG en comparación con las de 5K-P y 10K-P. Fue interesante observar que los 20K-P contenían casi un 50% de EGCG en los extractos.

En el caso del GT 2, se observó que los extractos mostraban la presencia de otros picos de la familia de las catequinas en el rango de 248-363 nm, como se observa en los diversos picos en este rango en la Fig. 9(b). La eliminación de las partículas del extracto dio lugar a desplazamientos de los picos. Especialmente los extractos mostraron desplazamientos distintos. Sin embargo, en el caso de las partículas 5K-P y 10K-P se observó que sólo mostraban picos de EGCG y a baja intensidad. El énfasis aquí es en las partículas 20K-P que mostraron picos de catequina de intensidad casi similar en comparación con los extractos. Se observó que, a diferencia de las partículas 5K-P y 10K-P, las 20K-P no sólo mostraron picos de EGCG, sino también otros picos de la familia de las catequinas, bastante similares a los de los extractos.

GT 3 (Fig. 9(c)), los extractos produjeron varios picos, incluidos los de las catequinas. Sin embargo, en comparación con el GT 1 y el GT 2, las propias partículas 5K-P y 10K-P mostraron picos de EGCG de alta intensidad. La tendencia de que las partículas 5K-P y 10K-P mostraron sólo el pico de EGCG se mantuvo también en el GT 3. Las 5K-P mostraron un mayor EGCG en comparación con sus homólogas del GT-1 y del GT 2, pero en comparación con las 10K-P del GT 3 fue mucho menor. Los 10K-P del GT 3 mostraron contenidos de EGCG similares a los de los extractos. Los 20K-P registraron en este caso los picos más altos de catequinas, superando también a los extractos. Se observaron desplazamientos de los picos similares a los registrados en la extracción con agua y con disolventes en el caso de los 20K-P frente a los extractos. Es interesante observar que los picos del 20K-P eran más estrechos y de mayor intensidad. En los 20K-P se observó un pico excepcionalmente alto a 269 nm correspondiente al EGC. La observación general de que los 20K-P contenían cantidades significativamente grandes de catequinas en el GT-1, el GT 2 y el GT 3 se confirmó mediante estos estudios.

FT-IR

El espectro FT-IR obtenido de las partículas 5K-P, 10K-P y 20K-P del GT 3 que mostraron la máxima actividad antibacteriana y propiedades únicas se presenta en la Fig. 10(a). Los espectros coinciden con la banda característica del EGCG. Ponnuraj et al, 201540 informan de huellas dactilares de EGCG en 3357,46 cm-1 para el grupo O-H unido al anillo aromático, 1691,27 cm-1 y 1616,06 cm-1 fuerte para el grupo C = O que une el grupo trihidroxibenzoato y el grupo cromano, 1447,31 cm-1 para el grupo C-H presente en el anillo cromano, 1348.00 cm-1, 1222,65 cm-1 para el grupo O-C = O, 1148,40 cm-1 para el grupo O-H, 1041,37 cm-1 para el grupo C-O-C que une el anillo Chroman y el anillo trihidroxibenzoato y 825,38 cm-1 para el grupo C-H en el anillo aromático. Resulta interesante y de apoyo observar que se ha observado un patrón distinto en función del aumento de la centrifugación que se corresponde con la disminución del tamaño de las partículas. A 5K-P las bandas de EGCG fueron las de menor intensidad, seguidas de 10K-P y 20K-P mostraron bandas de alta intensidad. Esto se correlaciona con los resultados observados también en los estudios UV.

La figura 10(b) muestra los espectros FT-IR obtenidos del GT 1 5K-P y 20K-P, En el caso del GT 1 no había mucha diferencia en las bandas de EGCG entre las dos partículas. Estos resultados coinciden con los observados también en el caso de los estudios espectrofotométricos UV. La figura 10(c) muestra los espectros comparativos de las 20K-P del GT 1, GT 2 y GT 3. El patrón de gradiente de aumento de las bandas de EGCG en el orden de GT 1 < GT 2 < GT 3 es evidente.