Secuenciación y ensamblaje GS-FLX y GS-FLXTM de Roche
Seis ejecuciones de secuenciación produjeron ≈910 Mb de tamaño total de datos equivalentes a 2.913.966 lecturas en bruto. Los archivos de secuencias en bruto están disponibles en el archivo de lecturas de secuencias (SRA) del NCBI en http://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?study=SRP006173, como archivos SRR172675 (S1), SRR172676 y SRR183482 (S2), SRR172677 (S3), SRR172678 y SRR183483 (S4), SRR172679 (S5) y SRR172680 (S6). La distribución de la frecuencia de la longitud de las lecturas en bruto se agrupó en torno al rango de 200 a 300 pb y de 300 a 400 pb como resultado del uso de dos plataformas diferentes para la secuenciación (Figura 1A). Un total de 2.700.168 lecturas (93% del total) entraron en el proceso de ensamblaje, que produjo 21.207 secuencias ensambladas de alta calidad (20.408 isotigs + 799 contigs¸ equivalentes al 87% de las lecturas que entraron en el ensamblaje y ≈82% de todas las secuencias ensambladas). Su longitud oscilaba entre 80 y 3.379 pb (Figura 1B) y su longitud media era de 1.014 pb (isotigs) y 930 pb (contigs). Un total de 178.636 lecturas (≈6% del total) permanecieron como singletons (profundidad de cobertura = 1); de éstas, sólo 5.113 secuencias limpias permanecieron tras el control de calidad. Los isótidos se incorporaron a 15.667 isogrupos. En la Tabla 1 se presenta un resumen del estado del proceso de secuenciación, ensamblaje y anotación (véase más adelante).
Distribución de la frecuencia de la longitud de las lecturas brutas de Amaranthus hypochondriacus (A) y de los isotigs/contigs ensamblados (B). La distribución de las lecturas refleja la utilización de diferentes plataformas de pirosecuenciación (GS-FLX 454 y GS-FLXTM).
Annotation of A. hypochondriacus contigs/isotigs
Todos los contigs/isotigs fueron consultados en las bases de datos nr, TAIR, UniRef100, UniRef50 y Amaranthaceae ESTs y PFAM para su anotación. Aproximadamente el 82% de todas las entradas produjeron coincidencias significativas (E ≤ 1 × 10-10) cuando se consultaron con la base de datos nr (Tabla 1). Las 3.901 secuencias sin resultados significativos frente a la base de datos nr se consultaron con la base de datos de dominios proteicos PFAM para determinar su función putativa. Sólo una pequeña fracción de estas secuencias (≈2%) produjo éxitos significativos (valores E ≤ 1 × 10-5) a los dominios de proteínas conocidas. Estos resultados están disponibles en el archivo adicional 1. La anotación de los 5.113 unigenes limpios frente a la base de datos TAIR produjo aproximadamente 1.000 aciertos significativos.
El mejor acierto para cada unigén consultado frente a la base de datos TAIR se utilizó para asignar la anotación funcional GO en términos de grupos de procesos biológicos (11.224 secuencias), funciones moleculares (11.499 secuencias) y componentes celulares (11.227 secuencias). Los resultados se resumen en la figura 2. Como era de esperar, el mayor porcentaje en cada grupo de GO (entre el 12% y el 15%) estaba conformado por contigs/isotigmas con una anotación funcional desconocida. No se observaron diferencias obvias en el número de secuencias asignadas a cada categoría, incluyendo la respuesta al estrés (a)biótico, entre el amaranto en grano y Arabidopsis thaliana. Esto fue probablemente un reflejo de la conocida capacidad de Arabidopsis de responder fuertemente al estrés abiótico y biótico a nivel transcripcional. Este resultado también argumenta en contra de la posibilidad de que el amaranto en grano posea una firma transcriptómica diferente, particularmente en las categorías de estrés y respuesta a estímulos, que podría explicar su característica tolerancia al estrés (a)biótico, en contraste con lo que se ha observado en especies de plantas adaptadas a hábitats extremos (por ejemplo, la halófila relacionada con Arabidopsis Thellungiella halophila y los manglares extremófilos). Así, la asignación funcional GO para Procesos Biológicos (Figura 2A) indicó que el 3% de los contigs/isotigmas se agruparon en respuesta a estrés/estímulos, el 2% en procesos de desarrollo y un 4% adicional en otros procesos biológicos y metabólicos. Estas categorías fueron de nuestro particular interés considerando que uno de los objetivos primordiales de este estudio del transcriptoma era proporcionar información que condujera a la identificación de los genes que responden al estrés (a)biótico (ver más adelante). Del número de transcritos a los que se asignó una función de defensa (1% del total), más de la mitad estaban asociados a la infección bacteriana (41%) y a la regulación del ácido jasmónico (JA) (24%), incluyendo muchos genes biosintéticos de JA (por ejemplo LOX13, AOS, AOC, OPR3) y genes que responden al JA (Figura 3A; véanse también los archivos adicionales 2, 3 y 4).
Resumen de la anotación funcional de Gene Ontology de los isotigs/contigs GS-FLX 454 y GS FLXTM. Las secuencias anotadas (frente a la base de datos TAIR) se clasificaron en (A) ‘Proceso biológico’, (B) ‘Función molecular’ y (C) ‘Componente celular’ grupos y 45 subgrupos.
Número de isotigs/contigs de A. hypochondriacus categorizados dentro de la respuesta al estrés biótico (A) y la función fitohormonal (B). BI, FI, INC, JA y SA representan la infección bacteriana y fúngica, la interacción planta-patógeno incompatible, el ácido jasmónico y el ácido salicílico, respectivamente. ABA, AUX, CK, ET y GA representan el ácido abscísico, las auxinas, las citoquininas, el etileno y las giberelinas, respectivamente.
La perspectiva general obtenida de la información anterior es que el amaranto de grano posee un arsenal diverso de genes para resistir la infección de patógenos y la herbivoría de insectos, la mayoría de los cuales se reportan por primera vez en esta especie. Estos incluyen genes potencialmente involucrados en la síntesis de oxalato y fitoecdysteroides (resultados no mostrados), que se cree que son armas defensivas eficaces en el amaranto y otras especies . La implementación de una respuesta defensiva relativamente robusta fue algo inesperado, al menos contra la herbivoría de insectos, considerando que la inusual alta tolerancia a la defoliación que hemos observado en las plantas de A. hypochondriacus (ver más abajo), podría esperarse que eximiera a esta especie de una inversión en respuestas defensivas inducibles metabólicamente costosas (por ejemplo, inhibidores de proteasa y lectinas). La naturaleza de los genes resistentes a patógenos aislados también era compleja, e incluía toda una gama de proteínas bacterianas y fúngicas inducidas por elicitores y relacionadas con la patogénesis, receptores extracelulares similares a los implicados en las respuestas de defensa inducidas por elicitores, proteasas, factores de transcripción (TF) y enzimas implicadas en la generación-detoxificación de especies reactivas de oxígeno.
También fueron importantes desde nuestra perspectiva los genes potencialmente implicados en la fotosíntesis compensatoria, la relocalización de carbohidratos (Tabla 2) y la regulación/síntesis de los niveles de fitohormonas (Figura 3B), posiblemente relacionados con el aumento de la ramificación observado en las plantas de amaranto en grano como respuesta a la defoliación causada por la herbivoría de insectos y/o los daños mecánicos . Muchos de los genes identificados pueden utilizarse para estudiar procesos no relacionados. Por ejemplo, se está llevando a cabo el análisis de los genes relacionados con las fitohormonas, en combinación con aquellos que muestran homología con los genes de floración, para obtener una visión de los mecanismos genéticos responsables de los diversos síntomas producidos por la infección de fitoplasma del amaranto de grano en el campo, incluyendo la filodia .
Comparación del transcriptoma entre A. hypochondriacus y A. tuberculatus
Los datos transcriptómicos brutos disponibles públicamente de pirosecuenciación 454 generados para A. tuberculatus fueron reensamblados utilizando los mismos métodos computacionales que para A. hypochondriacus. En nuestras manos, sin embargo, el ensamblaje produjo una proporción de contigs/singletons (12.216/53.803) que difería de la reportada por los primeros trabajadores (22.035/22.434), quizás como consecuencia del uso de diferentes ensambladores. La discrepancia se produjo a pesar de que se ensambló el 83% del total de lecturas brutas de A. tuberculatus que entraron en el proceso. El alineamiento BLASTN de los 12.216 contigs de A. tuberculatus resultantes con los 21.207 isotigs/contigs de A. hypochondriacus arrojó 8.260 secuencias homólogas (E ≤ 1 × 10-10 y ≥ 90% de identidad). El número de contigs de cada especie que produjeron coincidencias significativas (E ≤ 1 × 10-10) cuando se consultaron con las bases de datos Uniref 100 y Amaranthaceae ESTs, se muestra en la Tabla 3. El uso combinado de la información anterior condujo a la cuantificación del número de contigs homólogos que producen el mismo hit, hits diferentes, un hit para una especie y ninguno para la otra, y viceversa, y ningún hit. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 4. El análisis de los transcritos homólogos anotados con la base de datos EST de Amaranthaceae indicó que la mayoría tenía una función/procedencia desconocida (21%). La mayor proporción (71%) se encontró en las bibliotecas de EST generadas a partir de semillas inmaduras y tejidos florales en Chenopodium quinoa, inflorescencia, tejido germinativo, raíces en varios estados de desarrollo, hipocótilos, tallos de semillas y cotiledones de raíz de remolacha y células de clorénquima de la especie Bienertia sinuspersici que no es C4. Los genes relacionados con el estrés constituyeron la fracción más pequeña (8%), representada en su mayor parte por ESTs generadas a partir de especies halófitas con estrés salino (Salicornia brachiata, Suaeda salsa, S. maritima, Atriplex centralasiatica y C. glaucum, además de ESTs de tejido inmaduro de Salsola tragus. Todos los transcritos relacionados con el estrés biótico identificados procedían de bibliotecas de ADNc de raíces de remolacha sometidas a la alimentación de gusanos (Tetanops myopaeformis). Por otra parte, dos tercios de los transcritos homólogos anotados con la base de datos Uniref100 tenían una función desconocida. La clasificación posterior de los transcritos (33%) que tenían una función asignada en la categoría de procesos biológicos situó a la mayoría de ellos (16%) dentro de un grupo formado por funciones básicas de mantenimiento de la casa (por ejemplo, organización y biogénesis de componentes celulares, ciclo celular, muerte celular, regulación de la expresión génica, traducción, homeostasis celular, morfogénesis de estructuras anatómicas y crecimiento, procesos metabólicos de carbohidratos, proteínas y ADN, transporte y fotosíntesis), metabolismo primario y secundario (7%), transducción de señales y regulación de la transcripción (4%). El resto incluía transcritos expresados en respuesta al estrés biótico (2%) y abiótico (4%). La mayoría de estos últimos se aislaron de Amaranthaceae y de halófitas afines expuestas mayoritariamente a estrés salino, Entre los genes interesantes relacionados con el estrés (a)biótico presentes en ambas especies se incluye una proteína asociada al lípido plasmídico que se sabe que se induce en respuesta a múltiples estreses en muchas especies vegetales , AtPOB1 una proteína con dominio BTB/POZ que regula positivamente las respuestas a las enfermedades en Arabidopsis y tabaco, la proteína de la savia del floema AtPP2-A1, cuya sobreexpresión en Arabidopsis reprime fuertemente la alimentación por el floema del pulgón verde del melocotón Myzus persicae, un transcrito similar a la proteína no específica de transferencia de lípidos tipo 2 de Tamarix hispida, cuya expresión forma parte de una respuesta adaptativa al estrés abiótico en esta especie, la poliamina oxidasa, una enzima productora de H2O2 supuestamente implicada en los procesos de diferenciación de la pared celular y en las respuestas de defensa, que recientemente se ha descubierto que es necesaria para la cicatrización de heridas en el maíz, la metionina sulfóxido reductasa, que se ha descubierto que interviene en la defensa contra los patógenos en las plantas de pimiento, a través de la regulación del estado redox de las células, y la DEAD-box ATP-dependent RNA helicase 7, un tipo de proteína de reparación del ADN que se ha demostrado recientemente que confiere resistencia a múltiples estreses cuando se expresa en las plantas. También cabe destacar la identificación de varios genes relacionados con la homeostasis y la tolerancia a los iones de metales pesados, la desintoxicación de cationes, el transporte de agua y la biosíntesis de fitohormonas relacionadas con el estrés (por ejemplo, ácido abscísico y JA) y la transducción de señales (véase el archivo adicional 5).
El número de transcritos anotados que se detectaron en una sola especie fue comparativamente grande (Tabla 5). Un ejemplo ilustrativo de las diferencias observadas entre los transcriptomas de la maleza y del amaranto en grano viene dado por el análisis de los genes objetivo de los herbicidas que fueron anotados con las bases de datos UniRef 100 y Amaranthaceae ESTs. Se indicó que 29 de ellos se encontraron en ambas especies, mientras que 13 y 8 secuencias se encontraron sólo en A. hypochondriacus y A. tuberculatus, respectivamente (Tabla 6).
Los parámetros bastante estrictos empleados para la comparación del transcriptoma podrían haber conducido a las diferencias del transcriptoma aquí observadas, aunque el uso de umbrales de valores E más bajos (digamos E ≤ 1 × 10-5) podría no haber contribuido mucho a aumentar el nivel de homología de los transcritos, como sugiere un estudio previo de secuenciación del genoma en Eucalyptus grandis. Sin embargo, otra explicación posible más plausible es que las discrepancias anteriores fueran el reflejo de diferencias fundamentales en el diseño experimental general utilizado para generar ambos datos transcriptómicos. Por ejemplo, muchos genes relacionados con el estrés biótico detectados en A. hypochondriacus estaban ausentes en A. tuberculatus (resultados no mostrados). Una hipótesis alternativa que proponga que la diferencia observada se debió a una importante divergencia de secuencias ocurrida durante la especiación/domesticación requerirá mucha más investigación para ser validada.
Perfil de expresión digital
Perfil transcripcional sensible al estrés en hojas
Esta técnica, también conocida como muestreo de etiquetas o RNA-seq, se considera un método eficiente para el análisis de la expresión génica . El análisis del perfil de expresión digital realizado para A. hypochondriacus identificó un total de 1.971 genes expresados diferencialmente en respuesta a al menos uno de los cuatro tratamientos de estrés probados (es decir, estrés hídrico, estrés salino, herbivoría de insectos e infección bacteriana) (archivo adicional 6). Se generaron 50 perfiles diferentes de expresión génica para determinar la influencia de cualquier tratamiento de estrés en los niveles de expresión de un gen concreto. Los resultados se muestran en la Figura 4. Una característica evidente de este análisis fue el alto porcentaje de genes no anotados o con función desconocida que fueron inducidos por el estrés. Estos representan una fuente potencialmente rica de material genético que podría analizarse sistemáticamente para el descubrimiento de genes implicados en nuevos mecanismos de resistencia al estrés.
Número de contigs/isotigmas dentro de las 50 combinaciones de expresión génica generadas para categorizar los datos de expresión digital. Número de genes significativamente expresados en respuesta a: estrés salino , estrés hídrico , herbivoría de insectos e infección bacteriana ). Las letras en negrita representan los valores máximos de expresión (véase el texto).
También se tabularon todos los genes inducibles por estrés con función conocida que se identificaron en 41 de las 50 categorías de expresión génica (archivo adicional 7). Estos incluyen varios TFs conocidos por ser reguladores de las respuestas al estrés en otras especies de plantas, por ejemplo, la proteína similar a AREB, la proteína que contiene el dominio de dedos de zinc tipo Dof, la proteína que contiene el dominio BTB/POZ, la proteína que contiene dedos de zinc GRF, la proteína similar a RAP 2.4, el represor JAZ1, ATEBP/ERF72/RAP2.3 (relacionado con AP2-3), RAV, factor de transcripción similar a MYB, proteína 2 similar a TINY, factor de transcripción de dedos de zinc Cys2/His2, activador transcripcional de unión al motivo GAGA poco conocido, proteínas de dedos de zinc SCOF-1, inducidas por el estrés por frío o sal en Arabidopsis y otras plantas, aparentemente para potenciar la expresión génica dependiente de ABRE, un factor de transcripción putativo NAC y histona-fold/TFIID-TAF/NF-Y. Otros han sido identificados en varias xerófitas/halófitas como posibles factores que contribuyen a su capacidad para colonizar hábitats extremos, por ejemplo proteínas del canal de agua licopeno sintasa , mio-inositol-1-fosfato sintasa, cistationina gamma-sintasa fosfoenolpiruvato carboxilasa , antiportador Na+/H+ , proteína fosfatasa-2C , antiportador Ca2+/H+ , proteína similar a la calcineurina B , inositol monofosfatasa , y proteína hidrofílica inducida por sal .
No es de extrañar que numerosos transcritos que codifican los eliminadores de oxígeno reactivo fueran fuertemente inducidos, muchos de ellos por estrés múltiple, por ejemplo, la superóxido dismutasa, la glutatión S-transferasa Z1, la oxidasa similar a la germina y varias catalasas, peroxidasas y ascorbato peroxidasas. Además, la fuerte y múltiple inducción de la proteasa aspartílica, varias proteasas de cisteína, una proteasa similar a la subtilisina y una enzima de procesamiento vacuolar (VPE) apoyan un papel para los procesos de reciclaje de proteínas en respuesta al estrés, de forma similar a lo que se encontró durante el proceso de competencia de adaptación al estrés por salinidad en la extremófila T. halophila, mientras que la expresión de expansinas, endotransglicosilasas de xiloglucano, varias subunidades de celulosa sintasa, y proteínas ricas en glicina, prolina e hidroxiprolina está respaldada por la capacidad observada de ajustar las propiedades de la pared celular en muchas plantas sometidas a estrés. Muchos de estos genes activos en carbohidratos también se expresaron en gran medida en los tallos (véase más adelante).
De particular importancia fueron los genes altamente expresados por varios tratamientos de estrés, no reportados previamente en el amaranto o halófilos/extremófilos relacionados. Éstos tienen evidentes aplicaciones biotecnológicas potenciales y también podrían contribuir a la elucidación de los mecanismos moleculares que conducen a la resistencia a múltiples condiciones de estrés. Una selección incluye lo siguiente: Drm3, necesario para la metilación de novo del ADN en Arabidopsis thaliana, donde se ha propuesto que regula los procesos de silenciamiento génico; Enhancer of SOS 3- 1, que codifica una proteína localizada en el cloroplasto que interactúa con los reguladores críticos SOS3 y SOS2 de la tolerancia al estrés salino en Arabidopsis; las proteínas YCF3 y HCF101 (alta fluorescencia de la clorofila 101), consideradas esenciales para el ensamblaje y la acumulación del complejo del fotosistema I (PSI) y la prevención del daño fotooxidativo ; el factor de iniciación de la traducción eIF1, que resulta ser un determinante de la tolerancia al sodio en la levadura y las plantas, lo que implica que la traducción es un objetivo de la toxicidad de la sal y que su recuperación podría ser un mecanismo crucial para la supervivencia de las células en condiciones de estrés por NaCl, además de su propuesta de regulación de la acumulación de iones y del estado redox intracelular ; la proteasa FtsH 9 dependiente de ATP, implicada en la degradación de la proteína D1 del fotodiagnóstico (PSII), un paso necesario para evitar la acumulación de niveles excesivos de especies reactivas de oxígeno ; el transportador de electrones ACD1-LIKE, parecido al producto génico de la muerte celular acelerada de Arabidopsis, implicado en la oxigenación del feofórbido a que se requiere para evitar la destrucción fotooxidativa de la célula y que también se encuentra regulado al alza durante el proceso de adaptación al estrés salino en T. halophila; el gen de la prohibitina PHB1, cuyos miembros de la familia se han acumulado en respuesta a diferentes condiciones de estrés en muchas plantas, presumiblemente para actuar como salvaguardias de la función e integridad mitocondrial, desencadenantes de la señalización retrógrada de la mitocondria al núcleo y/o mediadores de la interacción entre el H2O2 y el NO, por un mecanismo aún no definido; la proteína Yellow Stripe Like 6, cuyos miembros participan, según la hipótesis, en el suministro de micronutrientes metálicos hacia y desde los tejidos vasculares y en la tolerancia e hiperacumulación de metales ; una variante putativa de la histona H1, que se expresa en condiciones de estrés por sequía en el tomate y que actúa por un mecanismo distinto de la organización de la cromatina, que se propone que implique una regulación negativa de la conductancia estomática; GASA-1/LtCOR1-like, una proteína regulada por la giberelina supuestamente implicada en la regulación de la maduración de la fruta o el establecimiento del estado de latencia en los meristemos cambiales de los árboles; cadenas de beta y gamma-tubulina, cuya expresión coincide con el papel cada vez más importante que desempeña el citoesqueleto en la mediación de la respuesta de la célula vegetal al estrés; el factor de iniciación de la traducción 5A, que se ha descubierto que está implicado en una regulación aparentemente dependiente de la isoforma de las vías de respuesta al estrés y la resistencia a través de un mecanismo en gran medida desconocido; el gen argonauta 4-like, la principal proteína implicada en la metilación de la heterocromatina y recientemente reconocida como un factor crítico para la señalización sistémica mediada por pequeños ARN, necesaria para las respuestas al estrés (a)biótico de las plantas y la privación de nutrientes; una arginasa putativa, que destaca el papel de la arginina como precursora de la biosíntesis de poliaminas y óxido nítrico, empleados como mensajeros para la adaptación de las plantas al estrés, y la proteína lectina similar a la toxina formadora de poros Hfr-2, reconocida como un importante factor de resistencia biótica en el trigo contra la infestación de la mosca de Hesse y la infección por hongos (Puccinia striiformis), e implicada en el cambio de fase vegetativa en el maíz, pero sin función conocida en la regulación del estrés abiótico. La caracterización funcional de un conjunto selecto de genes de A. hypochondriacus inducibles por estrés múltiple, en Arabidopsis, tabaco y/o amaranto en grano, se está llevando a cabo en nuestro laboratorio.
Perfil transcripcional en tallos
La comparación de la biblioteca de ADNc derivada del tallo (S6) con las generadas a partir de hojas sometidas a estrés biótico y abiótico (S2 a S5) permitió identificar un pequeño grupo de transcritos cuya expresión se detectó exclusivamente en los tallos. Sorprendentemente, la acumulación de varios otros transcritos fue mayor en los tallos que en el tejido foliar de las plantas de amaranto expuestas al estrés (a)biótico (véase el archivo adicional 8). El perfil de transcripción observado fue consistente con los datos previamente reportados para los análisis transcriptómicos del tallo en Arabidopsis thaliana. Todos los transcritos anotados se clasificaron en diferentes categorías, de forma similar a los estudios anteriores.
La biosíntesis de la lignina y de la cera cuticular estuvo representada por genes que codifican proteínas presumiblemente implicadas en la biosíntesis del monolignol (por ejemplo citocromo P450 reductasas, necesarias para la actividad de varias enzimas clave del citocromo P450 de la vía fenilpropanoide ), el transporte de monolignol (por ejemplo, transportadores ABC ) y la exportación de lípidos cuticulares (por ejemplo, familia de transportadores ABC del complejo blanco-marrón ). El modesto número de genes de biosíntesis de lignina regulados al alza que se detectó estaba probablemente relacionado con el uso de plantas jóvenes de amaranto, que aún no estaban en proceso de lignificación activa, para la experimentación.
La categoría de enzimas activas de carbohidratos estaba altamente representada. Esto no fue sorprendente si se tiene en cuenta que estas proteínas desempeñan un papel fundamental en la biosíntesis y modificación de la pared celular y, por tanto, están estrechamente reguladas durante el desarrollo del tallo. Incluía un número de glicosil transferasas y varias glicosil hidrolasas (GH) que representaban familias que tenían celulasa (GH9), β-1,3-glucanasa (GH3) xilanasa (GH10), xiloglucano endotransglucosilasa-hidrolasa (GH16), glucano endo-1,3-beta-D-glucosidasa (GH17), invertasa (GH31) y β-D-galactosidasa (GH35). Estas enzimas son necesarias para el desprendimiento y la elongación de la pared celular, la formación de las paredes celulares secundarias de los tejidos vasculares, la hidrólisis de la columna vertebral del xilano, las modificaciones postraduccionales (como las glicosilaciones) de las proteínas y la movilización de energía en forma de sacarosa. También se detectaron pectinas metilesterasas (PME) implicadas en la modificación de las propiedades físicas, químicas y biológicas de las pectinas. La expresión concomitante de un inhibidor de la PME probablemente representó una necesidad de regular la PME en los tallos jóvenes de amaranto para evitar la rigidificación de la pared asociada a la actividad de la PME. Además, se detectó una putativa proteína β-expansina; estas proteínas modulan la interacción entre las hemicelulosas y la celulosa presumiblemente a través de una interrupción de sus enlaces de hidrógeno compartidos.
Dentro del grupo de las oxido-reductasas extracelulares se encontraron dos peroxidasas, pertenecientes a las familias peroxidasa 25 y 64, respectivamente. Se ha encontrado que las peroxidasas se expresan a niveles de moderados a altos en los tallos en desarrollo, donde se cree que reducen la extensibilidad de la pared celular debido a su papel en la formación de enlaces covalentes entre los residuos de pectina, las proteínas ricas en hidroxiprolina como las extensinas y los precursores de la lignina. Se identificó un gen que codifica una oxidasa multicopar de la familia SKS (SKS5). La función de estas proteínas en el desarrollo del tallo no se conoce bien, aunque se ha descubierto que la expresión de SKS5 está regulada en los ecotipos hiperacumuladores de metales de Thlaspi caerulescens. Otra oxido-reductasa identificada en los tallos de amaranto fue una proteína 2-OG-Fe(II) oxigenasa de función desconocida que recientemente se encontró asociada a los mecanismos de defensa contra la infección por hongos en Arabidopsis.
Se identificaron varios genes que codifican proteínas con dominios de interacción putativos con polisacáridos y/o otras proteínas. Muchos de los genes clasificados dentro de esta categoría son quinasas, receptores peptídicos y quinasas similares a receptores que regulan los procesos de desarrollo en las plantas, como el receptor similar a CLAVATA1 , el receptor relacionado con CLAVATA3/ESR , la quinasa similar al receptor Abnormal Leaf Shape 2 , la quinasa similar al receptor rico en leucina RLK7 y la quinasa LRR XI-23 . Una serie de proteínas ricas en hidroxiprolina (glicoproteínas), que probablemente representen a las arabinogalactan-proteínas (AGP), proteínas estructurales (por ejemplo, extensinas, proteínas ricas en prolina, PRP) y una prolina 4-hidroxilasa relacionada (subunidad catalítica alfa-2) necesaria para la hidroxilación de los residuos de prolina , también se expresaron en gran medida en los tallos. Se han sugerido numerosas funciones de las AGP en el desarrollo de las plantas por su influencia en la determinación del destino celular, la embriogénesis somática y la proliferación celular. Además, se ha supuesto que los AGP son moléculas de señalización y que se asocian con polisacáridos pécticos, mientras que se ha demostrado que las extensinas, los PRP y otros (por ejemplo, las proteínas ricas en glicina) se expresan en tipos celulares específicos, incluidos los tejidos del xilema y del floema .
También estaban presentes los genes que codifican una endopeptidasa de tipo romboide 2, y dos proteínas con actividad inhibidora: un inhibidor de la proteína de transferencia de lípidos/tripsina-alfa amilasa y un inhibidor de la proteinasa de cisteína. Además, también se detectaron transcritos para una proteína F-Box (SKIP2) y una subunidad reguladora del proteasoma 26S no ATPasa, que se sabe que participan en la degradación selectiva de proteínas desencadenada en respuesta a varios estímulos durante el crecimiento y/o diversas condiciones de estrés. Se ha sugerido que la actividad de la proteinasa y su modulación por inhibidores de la proteinasa es necesaria para el procesamiento y/o el recambio de las proteínas de la pared celular, la generación de señales peptídicas, la muerte celular programada y/o el equilibrio de las tasas de expansión/proliferación celular, que se requieren colectivamente para el desarrollo adecuado del tallo .
Entre la categoría de proteínas diversas se encontraron genes que codifican proteínas implicadas en el metabolismo de los lípidos (GDSL-lipasas y una putativa glicerofosforil diéster fosfodiesterasa ), que se sugiere que son importantes para el desarrollo del tallo, una plantacianina de unión al cobre (ARPN), que se supone que regula los procesos de oxido-reducción en las paredes celulares, varias proteínas que se sabe que son necesarias para el mantenimiento de las células del tallo en el meristemo apical del brote (histona H2A; Aurora 2 histona quinasa), la tolerancia a los metales (p. ej.por ejemplo, la selenocisteína metiltransferasa) y componentes del citoesqueleto, muy probablemente implicados en la división y elongación celular. El hallazgo de un transcrito que codifica la subunidad catalítica LigB de una familia de dioxigenasas aromáticas de apertura de anillo (es decir, una putativa dopa dioxigenasa) la enzima prominente en la biosíntesis de la betacianina, y de glicosil transferasas (GTs) biosintéticamente relacionadas (por ejemplo, GT de Phytolacca Americana y una UDP-GT) fue consistente con el fenotipo altamente pigmentado del tejido del tallo utilizado para generar la biblioteca de ADNc secuenciada. La determinación de la estructura y la regulación de los genes relacionados con la pigmentación, sus patrones de expresión relacionados con el tejido y el estrés, y su probable papel en la defensa contra la herbivoría de los insectos en el amaranto de grano se está llevando a cabo activamente en nuestro laboratorio. También se detectaron varios TFs. De acuerdo con un informe anterior, la mayoría de los TFs encontrados para ser altamente expresados en el tejido del tallo del amaranto del grano eran de las familias MYB, AP2-EREBP, GRAS, bHLH-dominio y homeodominio (por ejemplo, WOX4 ). Los TFs en los tallos han sido asociados a la regulación de la biogénesis y diferenciación del tejido vascular, la expresión de genes fenilpropanoides y el desarrollo de las fibras. Finalmente, se encontró un alto nivel de expresión para varios genes relacionados con el estrés abiótico y la defensa en los tallos de A. hypochondriacus. La presencia de genes altamente expresados relacionados con la defensa estaba en consonancia con un informe reciente que mostraba que los genes implicados en la defensa de la planta y las funciones de protección eran dominantes en los tallos en desarrollo de Populus trichocarpa. En este sentido, la presencia concomitante de una putativa jasmonato o-metil transferasa y un gen de la CXE carboxilesterasa que codifica una proteína que presumiblemente puede identificar el metil jasmonato (MeJA) como su sustrato (además del salicilato de metilo y el indol-3-acetato) en Actinidia arguta, argumenta a favor de un posible papel del MeJA en la señalización, tanto dentro de las plantas de amaranto como entre ellas, durante el estrés biótico y/o abiótico . Otros genes interesantes identificados en los tallos de amaranto a los que se ha atribuido recientemente un papel activo en la defensa contra los patógenos son los que codifican una epóxido hidrolasa 2 y un VPE-1B , respectivamente. El papel de la epóxido hidrolasa en la defensa se cree que está asociado con su participación en la desintoxicación, la señalización y/o el metabolismo de los compuestos antimicrobianos, mientras que la importancia de VPE se cree que se deriva de su participación en la inmunidad desencadenada por elicitores conectados con la inducción combinada de una respuesta hipersensible (HR) y el cierre estomático. Como se ha mencionado anteriormente, la expresión del VPE también se ha asociado a las respuestas al estrés abiótico.