La familia de mediadores de transporte de cationes metálicos divalentes con dominio de cistationina-β-sintasa (CBS) (CNNMs) se compone de cuatro proteínas integrales de membrana asociadas al transporte de Mg2+. Estructuralmente, los CNNMs contienen grandes regiones citosólicas compuestas por un par CBS y un dominio de homología de unión a nucleótidos cíclicos (CNBH). Se desconoce cómo éstas regulan la actividad de transporte de Mg2+. Aquí, determinamos las estructuras cristalinas de los fragmentos citosólicos en dos conformaciones: Mg2+-ATP-análogo unido y libre de ligando. Las estructuras revelan conformaciones abiertas y cerradas con contactos funcionalmente importantes no observados en las estructuras de los dominios individuales. También identificamos una segunda región de unión a Mg2+ en el dominio CBS-par y una interfaz de dimerización diferente para el dominio CNBH. Los experimentos de ultracentrifugación analítica y calorimetría de valoración isotérmica revelaron una estrecha correlación entre la unión de Mg2+-ATP y la dimerización de la proteína. Las mutaciones que bloquearon cualquiera de las dos funciones impidieron la actividad celular de eflujo de Mg2+. Los resultados sugieren que el eflujo de Mg2+ está regulado por cambios conformacionales asociados con la unión de Mg2+-ATP a los dominios del par CBS de CNNM.