II Especificaciones de calidad microbiológica
Los animales no obióticos, ya sean axénicos (es decir, libres de gérmenes) o asociados a un microbioma definido consistente en unas pocas bacterias no patógenas, constituyen una pequeña fracción de los animales utilizados en la investigación; sin embargo, es probable que su uso aumente con el crecimiento de la investigación sobre las profundas influencias y los diversos efectos del microbioma en la salud humana y las respuestas experimentales de los modelos de investigación (Bech-Nielsen et al., 2012; Friswell et al., 2010; Grada y Weinbrecht, 2013). Como ya se ha mencionado, la mayoría de los animales de laboratorio se denominan SPF para indicar que el HM ha demostrado que están libres de patógenos en una lista de exclusión.
Las listas de exclusión para roedores, conejos y otras especies comunes de animales de laboratorio se han armonizado sustancialmente en todo el mundo desarrollado debido a los esfuerzos de las organizaciones científicas de animales de laboratorio (Guillen, 2012; Nicklas, 2008; Nicklas et al., 2002), y la globalización de la investigación biomédica. Además, la competencia por los clientes anima a los proveedores a ofrecer animales SPF libres de patógenos recién descubiertos y a los laboratorios de diagnóstico a desarrollar pruebas para esos patógenos (Shek, 2000). Las listas de exclusión de ratones y ratas libres de gérmenes patógenos específicos son más extensas que las de los conejos y otras especies de animales de laboratorio comunes por varias razones. En primer lugar, dado que los ratones y las ratas representan la gran mayoría de los animales utilizados en la investigación, es lógico que se conozcan más sus patógenos autóctonos que los de otras especies de animales de laboratorio menos utilizadas. La diversidad de cepas de roedores mutantes inmunodeficientes, tanto naturales como modificadas genéticamente, altamente susceptibles a las enfermedades infecciosas (Compton et al., 2003; Franklin, 2006), junto con métodos sensibles de inmunoensayo (Smith, 1986b) y los avances en genética molecular (Compton y Riley, 2001), han contribuido al descubrimiento y la caracterización de patógenos de roedores (Fox et al., 1994; Ward et al., 1994a) que se han encontrado como causa de infecciones ubicuas e inaparentes de las colonias de roedores de laboratorio (Hsu et al., 2006; Shames et al., 1995). Además, el predominio de los modelos de investigación con roedores murinos ha proporcionado fuertes incentivos para que los laboratorios de diagnóstico y los proveedores desarrollen y ofrezcan ensayos serológicos y de PCR específicos para patógenos virales y otros patógenos microbianos fastidiosos -no susceptibles de ser detectados por examen microscópico directo o aislamiento cultural- poco después de su descubrimiento. En cambio, los proveedores comerciales y los laboratorios de diagnóstico han tenido poca demanda por parte de las comunidades de investigación y medicina animal de laboratorio para proporcionar pruebas serológicas y de PCR de rutina para los virus del conejo reconocidos hace décadas, como el parvovirus lapino (Matsunaga y Matsuno, 1983) (cuya secuenciación ha demostrado recientemente que es un bocavirus (comunicación personal, K Henderson)), el coronavirus entérico del conejo (Deeb et al., 1993; Descoteaux y Lussier, 1990; Descoteaux et al., 1985), y el herpesvirus lepórido 2 (Matsunaga y Yamazaki, 1976). Por último, la rederivación mediante histerectomía o transferencia de embriones (TE) para eliminar todos los patógenos exógenos es la práctica habitual para los ratones y ratas de la FPS, pero no para otras especies.
Las listas de exclusión de la FPS para ratones y ratas han incluido todos los virus exógenos conocidos, independientemente de su virulencia, porque como parásitos intracelulares obligados, los virus son intrínsecamente invasivos; además, se ha demostrado que incluso las infecciones víricas no citopáticas alteran el metabolismo de las células del huésped (Oldstone et al., 1982). Sin embargo, la adhesión estricta al dogma de excluir todos los virus exógenos de los ratones y ratas SPF ha llegado a ser poco práctica en muchas instituciones de investigación en las que se considera que las infecciones asintomáticas por MNV, principalmente en ratones modificados genéticamente, están demasiado extendidas para ser eliminadas. Las técnicas de genética molecular más avanzadas han descubierto recientemente un astrovirus murino (Farkas et al., 2012), posiblemente más común en los ratones que el MNV, y seguramente encontrarán otros virus prevalentes que hasta ahora han eludido la detección porque, al igual que el MPV, el MNV y el astrovirus murino, están muy adaptados al huésped y, en general, son apatógenos incluso para los huéspedes inmunodeficientes. Como se ha señalado, las listas de exclusión viral de los conejos y otras especies de animales de laboratorio son menos completas que las de los roedores murinos.
Los ectoparásitos, los helmintos, los protozoos patógenos, las bacterias y los hongos forman parte de las listas de exclusión de todas las especies de animales SPF. Las bacterias y los hongos patógenos excluidos para los animales SPF se distinguen principalmente de los organismos comensales y autóctonos (es decir, autóctonos) por su capacidad de atravesar las barreras anatómicas y bioquímicas para establecerse en nichos desprovistos de otros microorganismos, como los tractos respiratorio inferior y urogenital, los órganos internos y los intracelulares (Casadevall y Pirofski, 2000; Council, 2009; Merrell y Falkow, 2004). La patogenicidad no es necesariamente una característica inmutable de la especie microbiana, ya que microbios normalmente comensales como Escherichia coli se han transformado en patógenos mediante la adquisición de genes de virulencia transferidos desde otras bacterias en elementos genéticos móviles como plásmidos, fagos y transposones (Dobrindt et al., 2004).
Los microbios se clasifican como patógenos primarios si pueden causar enfermedades en huéspedes inmunocompetentes. Algunos ejemplos son Salmonella, Mycoplasma pulmonis, Helicobacter hepaticus y Clostridium piliforme (la etiología de la enfermedad de Tyzzer). Los patógenos oportunistas como Pseudomonas aeruginosa, los estreptococos β-hemolíticos, Staphylococcus aureus y los hongos Pneumocystis causan la enfermedad principalmente en huéspedes inmunocomprometidos, ya sea (1) inmunodeprimidos por irradiación o quimioterapia (Bosma et al., 1983; Cryz et al., 1983; Flynn, 1963; Homberger et al, 1993; Rosen y Berk, 1977; Waggie et al., 1988; Walzer et al., 1989; Weir et al., 1986; Weisbroth et al., 1999) o (2) inherentemente inmunodeficientes, como los ratones atímicos desnudos y con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (Bosma et al., 1983; Clifford et al., 1995; Dole et al., 2013b; Henderson et al., 2012; Pantelouris, 1968; Ward et al., 1996). En su mayor parte, en las listas de exclusión del SPF para animales inmunocompetentes sólo se incluyen los patógenos microbianos primarios. Los oportunistas son añadidos, principalmente por los vendedores comerciales, a las listas de líneas mutantes inmunodeficientes y genéticamente modificadas. Dado que no es inusual que oportunistas como S. aureus causen enfermedades en cepas inmunocompetentes estándar (es decir, no modificadas genéticamente) de roedores (Besch-Williford y Franklin, 2007), que a menudo se utilizan en esquemas de rederivación y cría de líneas modificadas genéticamente, ha aumentado la demanda de cepas de roedores estándar e inmunocompetentes y de poblaciones libres de patógenos oportunistas y primarios. Este subgrupo de animales SPF se ha denominado SOPF por specific opportunistic pathogen-free (libre de patógenos oportunistas específicos).
Para resumir, los agentes infecciosos de las listas de exclusión SPF se determinan por criterios generales y específicos de la institución. En general, las listas de exclusión de SPF de ratones y ratas son más completas que las de especies animales menos populares porque se han identificado y estudiado más patógenos virales murinos autóctonos y microbianos adaptados al huésped; se dispone de ensayos serológicos y de PCR para los patógenos murinos poco después de su descubrimiento; y la rederivación para eliminar todos los patógenos exógenos de las poblaciones de ratones y ratas SPF es una práctica habitual. Las listas de exclusión de SPF de todas las especies suelen contener ectoparásitos, endoparásitos y microbios clasificados como patógenos primarios, así como virus; los proveedores suelen añadir patógenos oportunistas para los modelos murinos inmunodeficientes y mutantes de ingeniería genética.
Cumplir con las normas consensuadas de SPF puede ser problemático en una institución si la prevalencia de la infección es alta o los sistemas y prácticas de barrera son inadecuados para evitar que las infecciones adventicias vuelvan a aparecer y se propaguen. Muchas instituciones académicas que hacen un uso intensivo de la investigación han decidido que los beneficios de eliminar las infecciones prevalentes con agentes recientemente reconocidos como el MNV y el Helicobacter, que rara vez producen enfermedades y/o han sido endémicas en sus colonias de investigación durante muchos años, son superados por la interrupción de la investigación y los costes de hacerlo. Sin embargo, la eliminación (y la exclusión) de los patógenos prevalentes y el cumplimiento de las normas consensuadas del SPF reducen el riesgo de que un patógeno infecte otras colonias e interfiera en la investigación, y simplifica el intercambio de modelos animales y los estudios de colaboración con otros investigadores e instituciones.