Abstract
Objetivo. La prueba del pepsinógeno sérico tiene limitaciones en su poder predictivo como biomarcador no invasivo para el cribado del cáncer gástrico. Nuestro objetivo es investigar si la combinación de TFF3 y pepsinógeno podría ser un biomarcador eficaz para la detección del cáncer gástrico incluso en las primeras etapas. Métodos. En total, 281 pacientes con cáncer gástrico temprano (EGC), que se sometieron a una disección endoscópica de la submucosa en Corea, y 708 individuos sanos de Japón se inscribieron en la cohorte de derivación. La cohorte de validación incluyó 30 pacientes coreanos con CGA y 30 donantes de sangre sanos coreanos. Los niveles de TFF3 en suero se examinaron mediante un ensayo inmunoenzimático. Resultados. Utilizando un punto de corte de 6,73 ng/mL en la cohorte de derivación, la sensibilidad de la combinación de pruebas para la detección de CGA fue superior (87,5%) a la de TFF3 (80,4%) o a la de la prueba del pepsinógeno sola (39,5%). Del mismo modo, en la cohorte de validación, la sensibilidad de TFF3 más pepsinógeno fue superior (90,4%) a la de TFF3 (80,0%) o a la de la prueba de pepsinógeno sola (33,3%). Conclusiones. La combinación de TFF3 y pepsinógeno en suero es un biomarcador no invasivo más eficaz para la detección del cáncer gástrico en comparación con el pepsinógeno o el TFF3 solos, incluso en el CGA. Este ensayo está registrado con el NCT03046745.
1. Introducción
El cáncer gástrico es la tercera causa de muerte por cáncer en el mundo . Aproximadamente la mitad de los casos de cáncer gástrico se diagnostican en fases avanzadas. Una de las razones es la invasividad de las exploraciones de cribado por esofagogastroduodenoscopia (EGD) que lleva a los pacientes a evitar las pruebas necesarias . La limitación de la prueba del pepsinógeno como método de cribado serológico no invasivo de biomarcadores es que el valor de corte óptimo podría verse afectado por varios factores, como la infección por H. pylori, la edad, el sexo y el propio método de la prueba.
La familia de péptidos del factor trefoil (TFF) comprende pequeñas moléculas (12-22 kDa) que son secretadas por el tracto gastrointestinal de los mamíferos. Son extremadamente estables en condiciones ácidas y resistentes a la degradación por calor y a la digestión proteolítica. Los TFF constituyen una familia de tres péptidos (TFF1, TFF2 y TFF3) que se expresan ampliamente de forma específica en los tejidos del tracto gastrointestinal. El TFF3 se expresa en las células caliciformes del intestino delgado y grueso, así como en la metaplasia intestinal del estómago. El TFF3 sérico ha demostrado ser una herramienta de detección potencial del cáncer gástrico mejor que el pepsinógeno en Japón.
Estas características del TFF3 nos impulsaron a analizar si el TFF3 sérico puede ser un biomarcador del cáncer gástrico precoz (CGT) en coreanos, así como en la población japonesa. No existe ningún estudio previo sobre la TFF3 sérica como biomarcador en la población con CGA sin cáncer gástrico avanzado (CGA). Dado que la detección del cáncer en fase temprana se asocia a una mayor supervivencia, nuestra hipótesis es que la combinación de TFF3 con pepsinógeno podría mejorar la sensibilidad de la detección del CGA. Por lo tanto, investigamos si la combinación de las pruebas de TFF3 y pepsinógeno en suero podría ser una herramienta no invasiva más eficaz para la detección del CGA.
2. Materiales y métodos
2.1. Sujetos
2.1.1. Población de estudio de la cohorte de derivación
El grupo de pacientes estaba formado por 281 pacientes con CGA que se sometieron a una disección endoscópica de la submucosa en el Centro Médico de la Universidad Nacional de Kyungpook en Corea desde enero de 2011 hasta mayo de 2013. Se obtuvieron muestras de sangre de todos los pacientes antes de su tratamiento endoscópico. El grupo de control estaba formado por 708 donantes de sangre sanos, hombres y mujeres, que habían recibido un chequeo de salud en la Clínica Yamanaka de Japón desde octubre de 2011 hasta diciembre de 2012. Las muestras de biopsia para este estudio fueron proporcionadas por el Biobanco Nacional de Corea, del Hospital Universitario Nacional Kyungpook (KNUH), que cuenta con el apoyo del Ministerio de Salud, Bienestar y Asuntos. Todos los materiales derivados del Biobanco Nacional de Corea, KNUH, se obtuvieron bajo protocolos aprobados por la junta de revisión institucional.
2.1.2. Valor del TFF3 en la cohorte de validación
En la cohorte de derivación del presente estudio, el grupo de control estaba formado por individuos japoneses, y no hemos obtenido los resultados del pepsinógeno sérico en el grupo de control. Para probar nuestros resultados en otra cohorte de validación con pacientes y controles del mismo país, fue necesaria la cohorte de validación coreana. La cohorte de validación fue una cohorte independiente, que contenía 30 pacientes coreanos con CGA desde agosto de 2016 hasta diciembre de 2016 y 30 donantes de sangre coreanos sanos que recibieron un chequeo de salud que incluía una EGD desde agosto de 2016 hasta diciembre de 2016. Sus datos se recogieron y analizaron prospectivamente para validar el valor de TFF3. Los protocolos de estudio utilizados para los sujetos de la cohorte de validación fueron idénticos a los utilizados para los sujetos de la cohorte de derivación. La validez de la combinación de TFF3 y pepsinógeno para la detección de EGC en individuos coreanos se evaluó mediante un análisis de características operativas del receptor (ROC).
2.2. Métodos
2.2.1. Construcción de plásmidos de expresión de TFF3 humana
El ácido desoxirribonucleico complementario (ADNc) de TFF3 humana se clonó a partir del ADNc Marathon-Ready de intestino delgado humano (Clontech, Mountain View, CA, EE.UU.) mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Para la expresión en Escherichia coli con etiqueta His, los fragmentos de ADNc de TFF3 humano se insertaron en el vector pET-21a(+) (Novagen) para crear pET-hTFF3-His .
2.2.2. Expresión y purificación de la TFF3 humana recombinante
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL bacterias (Stratagene, Santa Clara, CA, EE.UU.) se transformaron con el plásmido pET-hTFF3-His y luego se cultivaron en medio de caldo de lisogenia a 37°C. La expresión de la proteína recombinante se indujo incubando las células con 1 mmol/L de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido durante 5 horas. Se cosecharon los pellets bacterianos, se extrajeron las fracciones de proteínas solubles por sonicación en 0,2% de Tritón X-100 y 50 mmol/L de Tris-HCl (pH 8,0), y se purificaron los TFF humanos recombinantes por cromatografía de Ni-Resina (Invitrogen, Tokio, Japón). Los TFF humanos recombinantes se eluyeron de la columna de Ni-Resina con 0,5 mol/L de imidazol, 50 mmol/L de Tris-HCl (pH 8,0) y 0,5 mol/L de NaCl. Cada fracción de elución se analizó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio y análisis de Western blot. Las concentraciones de los TFF humanos recombinantes purificados se midieron utilizando un ensayo de proteínas (Bio-Rad Laboratories Inc., Tokio, Japón). Los niveles de TFF3 en suero se midieron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los antisueros se prepararon a partir de conejos inmunizados con TFF humanos. La sensibilidad de TFF3 fue de 30 pg/mL. Los niveles de pepsinógeno I y pepsinógeno II en suero se midieron utilizando el inmunoensayo turbidimétrico mejorado con látex (Hitachi Ltd, Tokio, Japón), y se calculó la relación pepsinógeno I/pepsinógeno II.
Un estado de infección por H. pylori positivo dependía de que al menos una de las siguientes pruebas mostrara evidencia de infección: histología, prueba rápida de ureasa y prueba de aliento de -urea.
2.3. Análisis estadístico
Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático JMP7 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE.UU.) o con el SPSS versión 14.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). La media de las variables se comparó entre dos grupos mediante una prueba t. La curva ROC de cada evaluación se utilizó para extraer el punto de corte correspondiente, que puede utilizarse para discriminar diferentes estados gástricos. Para ello, se utilizó el área bajo cada curva ROC para medir la capacidad discriminatoria del modelo. El valor resultante del punto de corte para cada evaluación se aplicó a la determinación de la sensibilidad, la especificidad y la odds ratio. En consecuencia, se calcularon los intervalos de confianza del 95%. Un valor de dos caras inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
3. Resultados
3.1. Características de las cohortes de derivación y validación
En la cohorte de derivación, había 217 (75,8%) pacientes varones en el grupo de CGA y la del grupo de control eran 272 (38,4%). La edad media de los pacientes del grupo de cáncer era de 63,4 ± 9,3 años, y la de los controles era de 67,4 ± 11,9 años. La tasa de infección positiva por H. pylori en el grupo de cáncer fue del 48,4%. De los 281 tumores estudiados, 256 (91,1%) se clasificaron histológicamente como de tipo diferenciado y 25 (8,9%) como de tipo indiferenciado (Tabla 1). El nivel medio de TFF3 en suero en los pacientes con cáncer gástrico fue de 9,37 ± 4,67 ng/mL, que fue significativamente mayor en comparación con el del grupo de control (7,05 ± 3,28 ng/mL; ; Tabla 1, Figura 1).
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Los datos se presentan como media ± DE. TFF3: trefoil factor family 3; WD: adenocarcinoma bien diferenciado; MD: adenocarcinoma moderadamente diferenciado; PD: adenocarcinoma pobremente diferenciado; SRC: signet ring cell carcinoma; NA: no aplicable.
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Para la cohorte de validación, se inscribieron 30 pacientes coreanos con CGA y 30 sujetos coreanos de control sanos (Tabla 1). Había 21 (70,0%) pacientes masculinos en el grupo de CGA y 15 (50,0%) en el grupo de control. La edad media de los pacientes con CGA era de 59,5 ± 10,7 años, y la de los controles era de 66,6 ± 12,0 años. El nivel medio de TFF3 en suero en los pacientes con cáncer gástrico fue de 9,01 ± 4,21 ng/mL, que fue significativamente mayor que el del grupo de control (6,92 ± 2,76 ng/mL; ).
3.2. Efecto de la infección por H. pylori en los niveles de TFF3 en suero en la cohorte de derivación
Para comprobar la precisión diagnóstica de la TFF3 en suero para identificar la infección por H. pylori entre los pacientes con cáncer, se realizó un análisis ROC (datos no mostrados). El área bajo la curva ROC de TFF3 fue de 0,445.
Para probar la precisión diagnóstica de TFF3 en suero para identificar el CGA, se realizó un análisis ROC. Tanto para los pacientes positivos para H. pylori como para los negativos para Helicobacter pylori, la sensibilidad, la especificidad, la razón de momios, el área bajo la curva y el valor de corte para TFF3 fueron 0,804, 0,576, 5,60, 0,729 y 6,73, respectivamente. Los valores predictivos positivo y negativo para el TFF3 fueron de 0,430 y 0,881, respectivamente (Figura 2(a)). Para evaluar más a fondo el TFF3, se dividió a los pacientes según el estado de la infección por H. pylori y luego se realizó un análisis ROC. El área bajo la curva fue de 0,716 para los pacientes con H. pylori positivo (figura 2(b)) y de 0,740 para los pacientes con H. pylori negativo (figura 2(c)).
(a)
(b)
(c)
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(b)
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3.3. Tipos histológicos y niveles de TFF3 en suero en la cohorte de derivación
Para comprobar la influencia del CGA en los niveles de TFF3 en suero, se comparó el nivel de TFF3 en el suero de cada paciente con sus tipos histológicos de CGA. El cáncer gástrico diferenciado incluía casos con adenocarcinomas bien diferenciados o moderadamente diferenciados. El cáncer gástrico con histología de tipo indiferenciado incluía casos con adenocarcinoma poco diferenciado o carcinoma de células en anillo de sello. Los niveles de TFF3 en suero de los pacientes con el tipo diferenciado y de aquellos con el tipo indiferenciado de CGA no difirieron significativamente (9,53 ± 4,83 ng/mL frente a 7,66 ± 1,82 ng/mL, respectivamente; ). Por otra parte, el nivel de TFF3 en suero en los pacientes con CGA de tipo intestinal fue significativamente mayor que en los pacientes de tipo difuso (9,54 ± 4,78 ng/mL frente a 7,16 ± 1,89 ng/mL, respectivamente; ; Figura 3). En cualquier otro estado patológico del CGA, como la invasión submucosa o la invasión linfovascular, no hubo diferencias significativas en los niveles séricos de TFF3 (datos no mostrados).
(a)
(b)
(a)
(b)
3.4. Combinación de las pruebas de TFF3 en suero y pepsinógeno en la cohorte de derivación
Analizamos la utilidad de determinar el nivel de TFF3 junto con la prueba de pepsinógeno. El número de pacientes con cáncer gástrico y resultados positivos o negativos para ambas pruebas en el presente estudio se muestra en la Tabla 2. Los valores de corte para definir una prueba de pepsinógeno positiva fueron un nivel de pepsinógeno sérico I de <70 ng/mL y una relación pepsinógeno sérico I/II de <3. Con estos valores de corte, se demostró que 170 de los 281 pacientes con CGA no tenían cáncer con el cribado de pepsinógeno solo. Sin embargo, cuando se añadió la prueba de TFF3 en suero al cribado del cáncer gástrico, 135 de los 170 pacientes con CGA que no fueron identificados por la prueba de pepsinógeno pudieron ser identificados por el examen de TFF3. Por otra parte, 20 de los 281 pacientes no fueron detectados por el examen de TFF3 pero sí por el de pepsinógeno.
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TFF3: trefoil factor family 3. Prueba de pepsinógeno sérico (+): pepsinógeno I < 70 ng/mL y relación pepsinógeno I/II < 3.
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La sensibilidad de las pruebas individuales de pepsinógeno y TFF3 fue del 39,5% y del 80,4%, respectivamente. Con la prueba combinada, la sensibilidad para detectar la presencia de cáncer gástrico fue del 87,5%, que fue mayor que la de la prueba TFF3 por sí sola.
3.5. Combinación de las pruebas de TFF3 en suero y de pepsinógeno en la cohorte de validación coreana
Para comprobar el rendimiento diagnóstico de la prueba de pepsinógeno y de TFF3 en suero para identificar el CGA en la cohorte de validación coreana, se realizó un análisis ROC (Figura 4). La sensibilidad, la especificidad, la razón de momios y el área bajo la curva de la prueba de pepsinógeno para la detección de CGA según la definición de la prueba de pepsinógeno fueron 0,333, 0,933, 7,00 y 0,633, respectivamente. Utilizando el valor de corte de 6,73 ng/mL para el TFF3, los del TFF3 fueron 0,800, 0,433, 3,06 y 0,651, respectivamente. Los correspondientes a la combinación de TFF3 y relación l/ll de pepsinógeno fueron 0,900, 0,367, 5,21 y 0,756, respectivamente.
Los valores predictivos positivos y negativos de la relación pepsinógeno l/ll fueron de 0,833 y 0,583, respectivamente, y los del TFF3 fueron de 0,585 y 0,684, respectivamente. Los valores de la combinación de TFF3 y relación l/ll de pepsinógeno fueron de 0,587 y 0,786, respectivamente.
4. Discusión
La prueba del pepsinógeno se utiliza para el cribado del cáncer gástrico en Japón, donde la sensibilidad de la prueba en los estudios basados en la población oscila entre el 71% y el 84%, y la especificidad entre el 57% y el 78%. En el presente estudio, comparamos la TFF3 en suero con la prueba del pepsinógeno en suero como herramientas de cribado serológico para la detección del CGA en pacientes coreanos. La sensibilidad de la prueba del pepsinógeno fue del 39,5% en la cohorte derivada, mostrando una sensibilidad inferior a la de los estudios japoneses. Parece que la prueba del pepsinógeno para el cáncer gástrico se ve fácilmente influenciada por diversos factores, como el estado del H. pylori y el propio método de la prueba, y por lo tanto no cumple los criterios ideales de cribado . Por otro lado, la prueba de TFF3 en suero mostró una mayor sensibilidad (80,4%) que la prueba de pepsinógeno para detectar el CGA en nuestro estudio. Además, los resultados de la prueba de TFF3 en suero no se vieron influidos por el estado de H. pylori. Del mismo modo, un reciente estudio japonés sobre 1260 individuos sanos demostró que los valores de TFF3 en suero no se veían considerablemente afectados por el estado de H. pylori y su erradicación. Los autores sugirieron que la TFF3 sérica podría ser un biomarcador estable del cáncer gástrico incluso después de la erradicación del H. pylori, en contraste con la prueba del pepsinógeno . Debido a que el TFF3 no se expresa en las células epiteliales del estómago y sólo se expresa en las células caliciformes intestinales de la metaplasia, los niveles de TFF3 en suero están menos influenciados por la infección por H. pylori .
Los TFF que consisten en TFF1, TFF2 y TFF3 se expresan altamente en los tejidos que contienen células productoras de moco. Desempeñan un papel clave en el mantenimiento de la integridad de la mucosa y en la transformación oncogénica, el crecimiento y la extensión metastásica de los tumores sólidos . TFF3 se expresa en las células caliciformes del intestino delgado y grueso, así como en la metaplasia intestinal en el estómago.
Datos recientes indican que los TFF en suero, especialmente TFF3, podrían ser potenciales biomarcadores para la detección del cáncer gástrico. En un estudio japonés llevado a cabo en 183 pacientes con cáncer gástrico y 280 individuos sanos, utilizando un punto de corte de 3,6 ng/mL para TFF3, el odds ratio para el cáncer gástrico aumentó significativamente (odds ratio 18,1; intervalo de confianza del 95% 11,2-29,2) y la sensibilidad y especificidad para predecir el cáncer gástrico fueron 80,9 y 81,0%, respectivamente . Al comparar las curvas ROC del cociente I/II del pepsinógeno, del TFF3 y del TFF3 más el cociente I/II del pepsinógeno, se observó que el TFF3 más el pepsinógeno tenía mejores resultados como marcador de detección gástrica que el pepsinógeno o el test TFF3 solamente . En otro estudio realizado en 192 pacientes con cáncer gástrico y 1254 controles, la sensibilidad y la especificidad de la prueba del pepsinógeno para predecir el cáncer gástrico fueron del 67% y el 82%, respectivamente, mientras que la combinación de la prueba del TFF3 y el pepsinógeno en suero mostró una sensibilidad del 80 y una especificidad del 80% para detectar el cáncer gástrico . Estos resultados anteriores coinciden con los de nuestro estudio, en pacientes con CGA. También comparamos la combinación de TFF3 y pepsinógeno en suero con la prueba de TFF3 o pepsinógeno solamente. La curva ROC de TFF3 para predecir la presencia de CGA mostró que la sensibilidad, la especificidad y el área bajo la curva eran del 80,4%, el 57,6% y el 0,729, respectivamente, utilizando un punto de corte de 6,73 ng/mL en la cohorte de derivación. La sensibilidad de la combinación de pruebas (87,5%) para la detección de EGC fue superior a la del TFF3 (80,4%) o a la de la prueba del pepsinógeno sola (39,5%). Del mismo modo, en la cohorte de validación, la curva ROC de TFF3 mostró que la sensibilidad, la especificidad y el área bajo la curva eran del 80,0%, el 43,3% y el 0,651, respectivamente, utilizando un punto de corte de 6,73 ng/mL. El área bajo la curva de la TFF3 más la proporción de pepsinógeno I/II (0,756) fue mayor que la de la TFF3 sola (0,651) o la proporción de pepsinógeno I/II sola (0,633). Además, la sensibilidad de TFF3 más pepsinógeno (90,0%) fue mayor que la de TFF3 (80,0%) o la de la prueba de pepsinógeno sola (33,3%). El TFF3 es un marcador más útil que la prueba de pepsinógeno para la detección de CGA, y la combinación de TFF3 sérico más pepsinógeno es más eficaz que el TFF3 o el pepsinógeno solamente.
También evaluamos la relación entre el TFF3 y los tipos histológicos de CGA según la diferenciación y la clasificación de Lauren, respectivamente. Encontramos que los niveles de TFF3 en suero en pacientes con cáncer gástrico de tipo diferenciado eran más altos que en pacientes con histología de tipo indiferenciado, aunque estas diferencias no mostraron significación estadística (). Los niveles séricos de TFF3 en pacientes con cáncer gástrico de tipo intestinal fueron significativamente más altos que en aquellos con cáncer de tipo difuso (). Huang et al. informaron de concentraciones séricas de TFF3 más bajas en pacientes chinos con cánceres gástricos de tipo diferenciado e intestinal. Por lo tanto, los resultados de nuestro estudio no coinciden con su informe. Por el contrario, nuestro estudio coincide en gran medida con el informe de Kaise et al. en Japón, que descubrió que las sensibilidades de la prueba de TFF3 sola y la combinación de las pruebas de TFF3 y pepsinógeno en el adenocarcinoma de tipo diferenciado eran inferiores a las del cáncer de tipo intestinal. Dado que la TFF3 se expresa fuertemente en las células caliciformes del epitelio de la metaplasia intestinal del estómago (según la histopatogenia del cáncer gástrico), cabría esperar un nivel sérico elevado de TFF3 en los cánceres gástricos de tipo intestinal y de tipo diferenciado. Se necesitan más estudios a gran escala para explicar estos resultados controvertidos y las discrepancias entre los estudios anteriores.
La EGD es un examen invasivo utilizado para la detección precoz del cáncer gástrico, sobre todo en muchos sujetos asintomáticos. Los resultados positivos de la combinación de TFF3 y pepsinógeno en suero para el cáncer gástrico podrían ser útiles para animar a los pacientes a someterse a la EGD.
Hubo varias limitaciones en este estudio. Una de ellas fue el tamaño relativamente pequeño de la muestra. Sin embargo, nuestro estudio mostró resultados similares a través de dos cohortes independientes y éste es el primer estudio sobre la utilidad diagnóstica del TFF3, que incluyó sólo a pacientes con CGA, y no con CGA. En segundo lugar, la proporción de CGA de tipo difuso fue pequeña. Sin embargo, el estudio coreano anterior mostró resultados similares e informó de que el valor diagnóstico de la TFF3 sérica para el cáncer de tipo difuso era algo menor en comparación con el del cáncer gástrico de tipo intestinal, aunque la proporción de CGA era del 49,4% . En tercer lugar, los sujetos de control de la cohorte de derivación eran japoneses sanos y no individuos coreanos. Para superar esto y validar el presente estudio, analizamos una segunda cohorte de control coreana independiente y los resultados de ambas cohortes fueron similares. En cuarto lugar, nuestro estudio no demostró la detectabilidad de lesiones precancerosas, incluida la gastritis atrófica, mediante el TFF3.
En resumen, este estudio ha demostrado que el TFF3 sérico puede ser un biomarcador más eficaz de CGA en coreanos que la prueba del pepsinógeno. Además, la combinación de TFF3 y la prueba del pepsinógeno tenía un mayor poder diagnóstico como modalidad de cribado. Además, los resultados indicaron la posibilidad de que el nivel de TFF3 en suero se asocie con el tipo histológico y el tipo de diferenciación en el CGA. Se necesitan más estudios a gran escala para confirmar el fuerte poder predictivo de la TFF3 sérica y las pruebas combinadas con TFF3 y pepsinógeno en pacientes con AGC o EGC, así como para aclarar el papel de la TFF3 sérica como biomarcador no endoscópico en el cribado poblacional del cáncer gástrico.
Divulgación
Hyun Seok Lee es el primer autor.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no existen intereses contrapuestos en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimientos
Este estudio (información del ensayo clínico: NCT03046745) fue apoyado por una subvención del Programa Nacional de I+D para el Control del Cáncer, Ministerio de Salud &Bienestar, República de Corea (1631100).