Esto satisface prácticamente todos los casos desde el aula hasta el laboratorio de investigación hasta que consideramos los canales de cloruro. Sabemos que existen, que son importantes y que podrían ser buenas dianas farmacológicas en varias áreas de la enfermedad, pero hasta hace poco, han permanecido algo estigmatizados y fuera de moda en el mundo de la terapéutica. La falta de ligandos selectivos no ha ayudado en absoluto. La única excepción ha sido el receptor GABA-A, que está acoplado a un canal de cloruro intrínseco que se abre al unirse el neurotransmisor inhibidor GABA. Las benzodiacepinas han potenciado este receptor desde que el Valium estuvo disponible en la década de 1960, proporcionando efectos sedantes y anticonvulsivos. Esto introduce un concepto importante: hay varias familias de genes y diferentes tipos de proteínas que pueden describirse como canales de cloruro.
Esto contrasta con lo que entendemos de los canales iónicos selectivos de cationes, en los que hay poca flexibilidad en la estructura de la proteína que puede formar un poro selectivo para el potasio, el sodio o el calcio; la diversidad de estos canales iónicos se produce por las variaciones en los dominios proteicos distintos del poro que influyen en el comportamiento de apertura-cierre. Para ser justos, no parece haber muchas razones fisiológicas por las que un canal aniónico deba exhibir selectividad de cloruro, ya que hay poco papel fisiológico en el transporte de membrana de otros haluros o pequeños aniones; cualquier canal aniónico será por defecto un canal de cloruro desde un punto de vista fisiológico. Por otra parte, las corrientes de membrana de potasio, sodio y calcio desempeñan cada una de ellas diferentes papeles fundamentales y la permeabilidad selectiva de la membrana a estos cationes es crucial para la función celular y, de hecho, para la vida misma.
Los receptores GABA-A son miembros de las familias de canales iónicos pentaméricos con bucle cys, que incluyen varios tipos de canales excitatorios e inhibitorios activados por neurotransmisores. La proteína reguladora transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) es un canal de cloruro regulado por nucleótidos. Es un miembro de la diversa familia de transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) y es el único que no parece transportar ningún sustrato a través de una membrana, sino que funciona como un canal de cloruro. La familia CLC de canales de cloruro activados por voltaje surge de otra familia genética distinta y tiene una estructura general única entre las proteínas de membrana. Esta familia de proteínas ha dado lugar a muchas sorpresas en los últimos 30 años y aquí se presentarán los miembros de esta familia y también cómo podrían considerarse objetivos farmacológicos.
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Otros avances interesantes en el campo de los canales de cloruro han surgido tras la identificación molecular de las proteínas que subyacen a los canales de cloruro activados por el calcio (ClCa). Desde el punto de vista funcional, conocemos sus funciones fisiológicas desde hace tiempo, pero la reciente identificación molecular de las proteínas de los canales ha permitido el desarrollo de herramientas moleculares y farmacológicas para investigar y alterar su actividad. Esta revisión se centra en el potencial farmacológico de los canales ClCa y las proteínas CLC; su función y localización subcelular se resumen en la Figura 1.
Figura 1
Una introducción a las proteínas CLC
Los nueve miembros de esta familia de proteínas son CLC-1 a 7, CLC-KA y KB. El miembro fundador, CLC-1, es el canal de cloruro activado por voltaje del músculo esquelético y se discutirá más adelante. Se han realizado numerosos estudios funcionales sobre un homólogo con el título honorífico de CLC-0, aislado del órgano eléctrico Electroplax, que permite a la raya aturdir a sus víctimas acuáticas. La reconstitución de CLC-0 en bicapas lipídicas y el registro electrofisiológico de las corrientes que fluyen a través de canales iónicos individuales revelaron una propiedad intrigante. Normalmente, cuando se registra la corriente de un pequeño parche de membrana que contiene un único canal iónico, se observan fluctuaciones entre dos amplitudes de corriente: una que representa el canal cerrado y otra que representa la corriente que fluye por el canal abierto. Las fluctuaciones reflejan las transiciones entre los estados cinéticos abierto y cerrado. Sin embargo, en el caso de CLC-0, era evidente que la proteína del canal iónico único constaba de dos poros equivalentes que podían abrirse independientemente1. Por lo tanto, este canal se describió como de doble cañón (Figura 2). Por lo tanto, no fue una gran sorpresa que las estructuras cristalinas de los homólogos de las bacterias entéricas revelaran que el complejo proteico era un dímero, y que cada subunidad poseía una vía de conducción de iones2 (Figura 2).
Figura 2
La segunda sorpresa surgió cuando se llevaron a cabo experimentos funcionales detallados con el CLC-ec1 de E. coli. En lugar de funcionar como un canal de cloruro, como su pariente perdido hace tiempo en el músculo esquelético de los vertebrados, la CLC-ec1 es un transportador de intercambio de 2Cl-/H+, o antiportador, con una estequiometría de intercambio estricta de 2:13. Esta proteína es importante para la supervivencia de las bacterias entéricas en un pH bajo4 y es probable que aproveche un gradiente de cloruro para mantener el pH celular en un nivel tolerable. Por tanto, las CLC procariotas podrían ser objetivos de inhibidores para tratar la infección por E. coli o Salmonella patógenas4. El descubrimiento del comportamiento de intercambio iónico estimuló, naturalmente, nuevos esfuerzos para determinar si este intercambio de cloruro por protón existía en los CLC de mamíferos, partiendo de la base de que el intercambio Cl-/H+ podría ser la verdadera función de los CLC arquetípicos y los identificados como canales de cloruro podrían ser sólo excepciones a la regla. Este parece ser el caso, ya que hay pruebas sólidas de que los CLC-3 hasta los CLC-7 funcionan como transportadores de intercambio de 2Cl-/H+, residiendo principalmente en orgánulos intracelulares, mientras que los CLC-1, CLC-2, KA y KB son verdaderos canales iónicos conductores de cloruro de la membrana plasmática5-9. Dado que la propiedad arquetípica de los CLC es el transporte de intercambio, encontrándose en todas las formas de vida celular, la última subclase de proteínas, los canales de cloruro bona fide, pueden considerarse por tanto transportadores de cloruro «rotos», que han perdido el acoplamiento del transporte de cloruro al movimiento de un segundo ion sustrato.
CLC-1
Este fundador de la familia CLC es el canal de cloruro activado por voltaje del músculo esquelético y sirve para regular el potencial de membrana y repolarizar la membrana tras los potenciales de acción para relajar el músculo. En la mayoría de los tejidos, cabría esperar que los canales de potasio desempeñaran esta función, lo que hacen en el músculo cardíaco y liso, además de regular la excitabilidad de la membrana en otros tipos de células. El sistema de túbulos transversales es una extensión de la membrana plasmática (sarcolema) y penetra en el tejido contráctil. Es fundamental para la rápida propagación de la actividad eléctrica por todo el músculo y orquesta una contracción rápida y controlada. El eflujo de potasio desde las células musculares hacia el espacio confinado del túbulo t elevaría la concentración de potasio extracelular y colapsaría este gradiente de iones, lo que provocaría una despolarización prolongada de la membrana. Al desempeñar los canales de cloruro la función repolarizadora predominante, esto se evita. Las mutaciones de pérdida de función en el CLC-1 conducen a la miotonía en el hombre, las cabras y los ratones (para una revisión reciente, véase10) y se caracterizan por un deterioro de la relajación muscular, consistente con la pérdida de una corriente de membrana repolarizadora.
Con la expresión limitada al músculo esquelético, el CLC-1 podría ser un objetivo atractivo para los fármacos que controlan la contracción muscular mediante el aumento o la disminución de la función del CLC-1 y, por lo tanto, reducen o aumentan la excitabilidad muscular, respectivamente. Los compuestos que aumentan la función del CLC-1 podrían ser capaces de tratar la miotonía, especialmente en los casos en los que podrían compensar la pérdida parcial de la actividad del canal de cloruro. La inhibición del CLC-1 podría reducir el umbral de la contracción muscular y podría ser útil en casos de debilidad muscular o de enfermedades degenerativas como la distrofia muscular.
CLC-2
El canal de cloruro de rectificación interna, CLC-2, tiene una distribución tisular algo amplia. Se encuentra en las neuronas centrales, donde regula la actividad neuronal11-13. En los astrocitos, su orientación subcelular a las uniones celulares está regulada por una interacción con GlialCAM (MLC1), cuyas mutaciones alteran esta orientación y causan leucoencefalopatía megalencefálica14. Los intereses terapéuticos recientes implican la expresión de CLC-2 en la mucosa intestinal y los bronquiolos pulmonares, donde desempeña un papel en las secreciones intestinales y pulmonares, respectivamente. Se propuso que la lubiprostona, un fármaco utilizado clínicamente para aliviar el estreñimiento, ejerce su efecto mediante la activación de la CLC-2, pero este efecto es controvertido. Mientras que este compuesto activa los canales CLC-2 en algunos estudios, en otros regula el tráfico de CLC-2 y aumenta la función de CFTR a través de la activación del receptor de prostaglandina15,16. Sin embargo, sigue habiendo pruebas suficientes de que el aumento de la función del CLC-2 en las vías respiratorias podría proporcionar una vía alternativa de cloruro en la fibrosis quística17.
CLC-KA/KB
Estos canales de cloruro se expresan notablemente en los epitelios renales y contribuyen a la permeabilidad de las membranas celulares al flujo pasivo de cloruro. Tienen un papel clave en la rama ascendente y los túbulos distales de la nefrona, proporcionando una ruta basolateral para la reabsorción de cloruro, tras el transporte desde la orina primaria a través de la membrana apical. El gen CLCKB, que codifica el CLC-KB, es uno de los cinco genes que subyacen al síndrome de Bartter. Las mutaciones de pérdida de función en el CLC-KB dan lugar a una reabsorción defectuosa de cloruro y, por tanto, a un trastorno de pérdida de sal, que se asocia con poliuria. Una de las principales características de los individuos afectados por las mutaciones de la CLC-KB (tipo III de Bartter) es la presión arterial baja. Una forma más grave de la enfermedad está causada por mutaciones en el gen BSND (tipo IV de Bartter), que codifica la Barttina, una proteína accesoria importante para el tráfico de la CLC-KA y la KB a la membrana plasmática18. Esta forma del trastorno también incluye la sordera sensorial, que se cree que se produce por la pérdida del tráfico tanto de CLC-KA como de KB a las membranas epiteliales del oído interno. Presumiblemente, la pérdida de la actividad de la CLC-KA o de la KB, pero no de ambas, puede ser tolerada por el sistema auditivo. Esto sugiere que los inhibidores selectivos para la CLC-KA o la CLC-KB, o la inhibición parcial de ambas, pueden actuar como un nuevo diurético de asa con el potencial de reducir la presión arterial y con pocos efectos secundarios. Esto ha llevado al estudio de su farmacología y al desarrollo de nuevos derivados inhibidores con baja afinidad micromolar19, que tuvieron efectos diuréticos cuando se administraron a ratas20. Por otra parte, los fármacos que activan los canales CLC-KB pueden potenciar la actividad residual de los canales defectuosos en pacientes con Bartter tipo III.
CLC-7
De la subclase de transportadores de intercambio 2Cl-/H+, CLC-7 es una prometedora diana para la acción de los fármacos y su inhibición puede ser beneficiosa en la osteoporosis. Una vez más, esta indicación tiene su origen en las observaciones de la enfermedad humana causada por mutaciones de pérdida de función en CLC-7, que causan osteropetrosis21. En este trastorno, la remodelación ósea por parte de los osteoclastos es deficiente, lo que se cree que está causado por una secreción defectuosa de ácidos y enzimas. Esto da lugar a un hueso denso, que si se reproduce mediante un inhibidor de la CLC-7 podría reducir la disolución del hueso y, por tanto, fortalecer el esqueleto de los pacientes con osteoporosis22,23. En estudios de prueba de concepto, la inhibición farmacológica de la acidificación24 o la interrupción de la función de CLC-7 mediante anticuerpos25 redujo la resorción ósea. Sin embargo, la inhibición de CLC-7 puede no estar exenta de complicaciones, ya que los estudios en humanos y ratones sugieren que la falta de función de CLC-7 también puede estar asociada a trastornos de almacenamiento y degeneración neuronal debido a la reducción de la función lisosomal26.
Mutaciones humanas de pérdida de función – lecciones de la CFTR
Merece la pena hacer una breve pausa en este punto para considerar que algunas de las indicaciones terapéuticas de los nuevos fármacos dirigidos a la CAC tienen como objetivo tratar trastornos distintos y en el extremo opuesto del espectro de los causados por la función defectuosa de la CAC. Además de las descritas anteriormente, la enfermedad de Dent I es una enfermedad renal ligada al cromosoma X que está causada por la pérdida de la función de la CLC-5 (véase27 para una revisión reciente). Todos son trastornos hereditarios raros y el principal defecto de la proteína implica una actividad reducida de la proteína o el tráfico a la membrana de destino. De hecho, muchas mutaciones individuales causan retención en el RE y una falta de maduración de la proteína. Se podría hacer un paralelismo con la fibrosis quística, ya que la mayoría de los individuos afectados poseen la mutación ΔF508 de retención del RE. Los enfoques recientes y estratificados para tratar la fibrosis quística han sido el resultado de un ataque doble para corregir el plegamiento de la proteína mutante (correctores de la FQ) y/o aumentar la actividad de los canales de cloruro CFTR de la membrana plasmática (potenciadores de la FQ). Están surgiendo éxitos con la clase de potenciadores28 , que son eficaces en pacientes con mutaciones que reducen la actividad de CFTR sin pérdida de la biosíntesis o el tráfico de la proteína (por ejemplo, G551D), sin embargo, la eficacia de los correctores del plegamiento (que se requiere en la mayoría de los casos) sigue sin establecerse29. Aunque las enfermedades asociadas a la pérdida de la función de la CAC son todas ellas trastornos genéticos raros, es posible que algún día podamos tratar a los individuos con miotonía, síndrome de Bartter, enfermedad de Dent y osteopetrosis, así como con fibrosis quística, con fármacos que corrijan la causa real de su trastorno.
Canales de cloruro activados por el calcio
Por último, se mencionarán los canales de cloruro activados por el calcio (ClCa), que tienen funciones fisiológicas claramente definidas en varios tipos de células y, sin embargo, su identificación molecular sufrió algunos comienzos falsos y tartamudos. La historia involucra a cuatro tipos de proteínas: miembros de las familias de genes CLCA, Bestrophin, Tweety y TMEM16. En todos los casos, su sobreexpresión recombinante dio lugar a la generación de corrientes de cloruro de membrana que son estimuladas por el aumento de la concentración de calcio intracelular y, en diversos grados, por la despolarización de la membrana. El periplo de la CLCA llegó a su fin cuando se descubrió que se trataba de una proteína secretada, pero que probablemente también regulaba la expresión de membrana de los canales de ClCa endógenos al sistema de expresión30. Las proteínas Tweety y Bestrophin no muestran todas las propiedades de los canales de ClCa estudiados en los principales tejidos, aunque Best1 parece ser responsable de un componente de ClCa en las neuronas sensoriales31 y también puede ser un importante regulador de la liberación de calcio del retículo endoplásmico32,33. Tres estudios independientes propusieron el TMEM16A (también llamado Ano1) como candidato a componente principal, si no en su totalidad, de un canal de cloruro activado por calcio34-36. Muchos estudios posteriores, facilitados por la generación de herramientas moleculares, lo han apoyado. El TMEM16A es importante para regular la excitabilidad de la membrana en el músculo liso vascular, está regulado al alza en un modelo animal de hipertensión pulmonar y el tono puede reducirse mediante la inhibición del canal37,38. En las neuronas sensoriales, la TMEM16A asocia la presencia de mediadores inflamatorios a la hiperexcitabilidad de la membrana y la inhibición de la TMEM16A tiene efectos antinociceptivos39. En modelos animales de asma, la expresión de este canal de cloruro en particular está aumentada, y su inhibición puede tener efectos beneficiosos40. También se encuentra en las células intersticiales de Cajal del intestino y la función del canal es necesaria para la contracción rítmica del músculo liso en la pared intestinal41. Además, la activación de TMEM16A puede proporcionar una vía alternativa para la secreción epitelial de cloruro en la fibrosis quística42. Aunque todavía se discute la función precisa del resto de la familia TMEM16, también se ha atribuido la función ClCa a TMEM16B (Ano2), que se cree que subyace al canal ClCa en las células ciliadas olfativas43,44. También puede haber funciones para esta clase de canal iónico en la biología de las células cancerosas y su inhibición puede impedir la proliferación celular45-48.
Observaciones finales
Esta revisión ha puesto de relieve las diversas funciones de las proteínas conductoras o transportadoras de cloruro y cómo su disfunción se acopla a los trastornos humanos o a los síntomas similares a los de la enfermedad en modelos animales. Hay una gran carencia de reactivos farmacológicos que inhiban, activen o mejoren el tráfico de membrana de los canales y transportadores de cloruro. Se está avanzando en el desarrollo de fármacos que reviertan la función defectuosa del CFTR en la fibrosis quística, lo que se espera que dé lugar a medicamentos específicos para los distintos tipos de mutación heredada. Los inhibidores y activadores de los canales de cloruro activados por el calcio TMEM16A42,49 están demostrando ser útiles herramientas de laboratorio y los nuevos compuestos podrían ser fármacos eficaces, sobre todo si pueden producir efectos específicos en los tejidos. Las moléculas específicas para determinados CAC son probablemente las más difíciles de encontrar. La comprensión de las bases estructurales de la activación de las CAC con voltaje50 podría identificar los dominios proteicos a los que se puede dirigir el diseño racional de fármacos basado en la estructura. Estas herramientas nos permitirán poner a prueba algunas de las nuevas ideas terapéuticas que se han revisado y presentado aquí.
Biografía del autor
El Dr. Jon Lippiat completó su doctorado sobre la estructura, función y farmacología de los canales de potasio en la Universidad de Leicester. Estudió la función de las células beta pancreáticas y la diabetes en la Universidad de Oxford antes de ser nombrado profesor de farmacología en la Universidad de Leeds. Su investigación consiste en dilucidar las propiedades estructurales y fisiológicas de distintos tipos de canales y transportadores de iones, así como en su posible orientación mediante nuevos reactivos farmacológicos.