Laine no se dedicó a cantar profesionalmente hasta la mitad de su veintena. Sus primeras influencias como cantante fueron Ella Fitzgerald, Sarah Vaughan, Judy Garland y Lena Horne. A los 24 años se presentó con éxito al pequeño grupo de John Dankworth, los Dankworth Seven, y posteriormente a su orquesta, con la que actuó hasta 1958. Dankworth y Laine se casaron ese año en secreto en el Registro Civil de Hampstead. Los únicos testigos fueron el amigo de la pareja, el pianista Ken Moule, y el arreglista de Dankworth, David Lindup. La pareja tuvo dos hijos, ambos músicos de éxito por derecho propio: Alec, que vive en Estados Unidos, y Jacqui, una cantante británica que ha publicado varios álbumes.
Interpretó el papel principal de una nueva obra en el Royal Court Theatre de Londres, sede de la nueva ola de dramaturgos de los años 50, como John Osborne y Harold Pinter. Esto la llevó a otras actuaciones en el escenario, como el musical Valmouth en 1959, la obra A Time to Laugh (con Robert Morley y Ruth Gordon) en 1962, Boots With Strawberry Jam (con John Neville) en 1968, y finalmente a su papel de Julie La Verne en la producción de Wendy Toye de Show Boat en el Teatro Adelphi de Londres en 1971. Show Boat tuvo su mayor duración hasta la fecha en esa temporada londinense con 910 representaciones.
Durante este período, tuvo dos grandes éxitos discográficos. «You’ll Answer to Me» alcanzó el Top 10 británico, mientras que Laine fue «prima donna» en la producción del Festival de Edimburgo de 1961 de la ópera/ballet de Kurt Weill Los siete pecados capitales, dirigida y coreografiada por Kenneth MacMillan. En 1964, su álbum Shakespeare and All that Jazz con Dankworth tuvo una buena acogida. Dankworth y Laine fundaron el teatro Stables en 1970 en lo que era el antiguo bloque de establos en los terrenos de su casa. Fue un éxito inmediato, con 47 conciertos en el primer año.
Laine comenzó sus actividades internacionales en 1972, con una exitosa primera gira por Australia, donde publicó seis álbumes entre los 100 más vendidos a lo largo de la década de 1970. Poco después, su carrera en Estados Unidos se inició con un concierto en el Lincoln Center de Nueva York, al que siguió, en 1973, la primera de sus muchas apariciones en el Carnegie Hall. Pronto le siguieron giras de costa a costa por Estados Unidos y Canadá, y con ellas una sucesión de discos y apariciones en televisión, como en The Muppet Show en 1977. Tras varias nominaciones, obtuvo su primer premio Grammy, en reconocimiento a la grabación en directo de su concierto en el Carnegie de 1983. Ha seguido realizando giras periódicas, entre ellas en Australia en 2005.
Ha colaborado con James Galway, Nigel Kennedy, Julian Lloyd Webber y John Williams. Otras grabaciones importantes durante esa época fueron los álbumes de dúos con Ray Charles (Porgy and Bess), así como Pierrot Lunaire de Arnold Schoenberg, por el que recibió una nominación a los premios Grammy.
Laine comenzó su relación con el teatro musical en Gran Bretaña y continuó en Estados Unidos con actuaciones estelares en A Little Night Music de Sondheim y La viuda alegre de Franz Lehár (Ópera de Michigan). En 1980 protagonizó Colette, un musical de Dankworth. El espectáculo comenzó en el teatro Stables de Wavendon en 1979 y se trasladó al Comedy Theatre de Londres en septiembre de 1980. En 1985 interpretó el papel de la princesa Puffer en el musical de Broadway El misterio de Edwin Drood, por el que recibió una nominación al Tony. En 1989 fue aclamada por la crítica de Los Ángeles por su interpretación de la Bruja en la obra de Sondheim Into the Woods.
En mayo de 1992, Laine actuó junto a Frank Sinatra durante una semana de conciertos en el Royal Albert Hall de Londres.
A finales de la década de 1990, los conciertos de Laine agotaron las entradas en todo el mundo, normalmente apoyada por Dankworth con su banda, orquesta o grupo más pequeño. Su banda habitual incluía a John Horler (piano), Alec Dankworth (bajo), Allan Ganley (batería) y Mark Nightingale (trombón).
Laine publicó su autobiografía, Cleo, en septiembre de 1994 en Simon & Schuster. Su segundo libro, You Can Sing If You Want To, fue publicado por Victor Gollancz en octubre de 1997. En el año 2000, apareció como la vocalista Gwen en la película The Last of the Blonde Bombshells.
En la lista de honores del Año Nuevo de 1997, Laine se convirtió en Dame Commander, y fue nombrada Dame Cleo Laine DBE. En la lista de Honores de Año Nuevo de 2006, su marido fue nombrado caballero soltero, convirtiéndose en Sir John Dankworth. Fueron una de las pocas parejas en las que ambos ostentaron sus títulos por derecho propio y la única pareja de jazz en ser reconocida de esta manera.
Dankworth falleció el 6 de febrero de 2010, horas antes de un concierto previsto en el teatro Stables de Wavendon para celebrar el 40º aniversario del local. Llevaba varios meses enfermo tras una gira de conciertos en Estados Unidos. A pesar de su dolor, Laine actuó en el concierto del 40 aniversario, junto con la John Dankworth Big Band y varios miembros de su familia, y sólo anunció su muerte al final. La decisión de Laine de actuar apareció en las portadas de los periódicos de todo el mundo, incluida una fotografía suya completa en la primera página de The Times.
Una semana después de la muerte de Dankworth, Laine sustituyó a su difunto marido y apareció de nuevo en concierto en Pinner, al noroeste de Londres. Laine siguió actuando y concediendo entrevistas en los meses siguientes a la muerte de Dankworth. Apareció como cabeza de cartel en el festival Music in the Garden en Wavendon en junio y julio de 2010.
En marzo de 2010, la última colaboración musical de Laine y Dankworth se publicó en CD y para su descarga: Jazz Matters. La grabación incluía a la Dankworth Big Band tocando nuevas composiciones escritas por Dankworth para la actuación de la pareja en los Proms de 2007 en el Royal Albert Hall.
Laine es famosa no sólo por su estilo interpretativo, sino también por su rango de casi cuatro octavas y su adaptabilidad vocal. Además de sus profundas y conmovedoras notas, el scatting y las notas altas de Laine se han convertido en su firma. Aunque su registro natural es el de una contralto, es capaz de producir un sol por encima del do agudo. Derek Jewel, del Sunday Times, la apodó «sencillamente la mejor cantante del mundo»
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