El método Sanger se utiliza para amplificar un segmento objetivo de ADN, de modo que la secuencia de ADN pueda determinarse con precisión. La incorporación de ddNTPs en las válvulas de reacción se utiliza simplemente para terminar la síntesis de una cadena de ADN en crecimiento, dando lugar a fragmentos de ADN parcialmente replicados. Esto se debe a que la ADN polimerasa requiere el grupo 3′ OH de la cadena en crecimiento y el grupo 5′ fosfato del dNTP entrante para crear un enlace fosfodiéster. En ocasiones, la ADN polimerasa incorporará un ddNTP y la ausencia del grupo 3′ OH interrumpirá la reacción de condensación entre el fosfato 5′ (tras la escisión del pirofosfato) del nucleótido entrante con el grupo hidroxilo 3′ del nucleótido anterior en la cadena en crecimiento. Esta reacción de condensación se produce normalmente con la incorporación de un dNTP no modificado por la ADN polimerasa. En términos sencillos, el ataque nucleofílico del grupo 3′ OH da lugar a la adición de un nucleótido a la cadena en crecimiento. La ausencia del grupo hidroxilo 3′ inhibe que se produzca este ataque nucleofílico, inhabilitando la capacidad de las ADN polimerasas para continuar con su función.
Este descubrimiento dio lugar a su apropiado nombre «nucleótidos terminadores de cadena». Los dideoxirribonucleótidos no tienen un grupo hidroxilo 3′, por lo que no puede producirse más elongación de la cadena una vez que este dideoxinucleótido está en la cadena. Esto puede llevar a la terminación de la secuencia de ADN. Por lo tanto, estas moléculas constituyen la base del método de terminación de la cadena de dideoxis en la secuenciación del ADN, que fue presentado por Frederick Sanger y su equipo en 1977 como una extensión de un trabajo anterior. El método de Sanger se describió en 2001 como uno de los dos métodos fundamentales para la secuenciación de fragmentos de ADN (el otro es el método Maxam-Gilbert), pero el método de Sanger es el «más utilizado y el que emplean la mayoría de los secuenciadores de ADN automatizados». Sanger ganó su segundo Premio Nobel de Química en 1980, compartiéndolo con Walter Gilbert («por sus contribuciones relativas a la determinación de las secuencias de bases en los ácidos nucleicos») y con Paul Berg («por sus estudios fundamentales de la bioquímica de los ácidos nucleicos, con especial atención al ADN recombinante»), y habló del uso de los dideoxinucleótidos en su conferencia del Nobel.
Secuenciación del ADNEditar
Los dideoxinucleótidos son útiles en la secuenciación del ADN en combinación con la electroforesis. Una muestra de ADN que se somete a la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en una mezcla que contiene los cuatro desoxinucleótidos y un dideoxinucleótido producirá hebras de longitud igual a la posición de cada base del tipo que complementa al tipo que tiene un dideoxinucleótido presente. La taq polimerasa utilizada en la PCR favorece al ddGNTP, lo que ha sido un patrón observado en varias investigaciones. Es decir, cada base nucleotídica de ese tipo particular tiene una probabilidad de estar unida no a un desoxinucleótido sino a un dideoxinucleótido, lo que termina la elongación de la cadena. Por lo tanto, si la muestra se somete a electroforesis, habrá una banda presente para cada longitud en la que esté presente el complemento del dideoxinucleótido. En la actualidad es habitual utilizar dideoxinucleótidos fluorescentes de forma que cada uno de los cuatro tenga una fluorescencia diferente que pueda ser detectada por un secuenciador; de esta forma sólo se necesita una reacción.