Abstract
Los estudios sobre los efectos de los polisacáridos de arabinoxilano (AX) en la respuesta postprandial de la glucosa han dado resultados contrastados debido a la diversidad de las estructuras de los AX. Se utilizaron cuatro extractos de AX extraíbles en agua (WEAX) obtenidos de la aleurona y el salvado de trigo para investigar (a) el efecto de los AX en las actividades de la α-amilasa y la α-glucosidasa, (b) la influencia de la composición química de los AX en su potencia de inhibición, y (c) la cinética de la inhibición enzimática. La actividad de la α-amilasa no se vio significativamente afectada por la presencia de fracciones de WEAX, independientemente del tipo o la concentración. WEAX inhibió la actividad de la α-glucosidasa sólo cuando se utilizó maltosa como sustrato, pero no sacarosa. Los valores IC50 de WEAX (- mg/mL) estaban altamente correlacionados con el contenido de ácido ferúlico (), la relación arabinosa/xilosa (), y las proporciones relativas de xilosa no sustituida (), disustituida (), y monosustituida (). El gráfico de Lineweaver-Burk sugirió un modo de inhibición enzimática no competitivo. Así, nuestros resultados sugieren que las propiedades antiglicémicas de WEAX pueden derivarse de la inhibición directa de la actividad de la α-glucosidasa.
1. Introducción
La prevalencia de la diabetes tipo 2 está aumentando en todo el mundo. La diabetes es una enfermedad crónica caracterizada por una elevada glucosa plasmática circulante. Por lo tanto, la gestión de la glucosa posprandial es fundamental en la prevención y el tratamiento de los pacientes con diabetes de tipo 2. Los estudios de intervención en humanos han demostrado que el consumo de una dieta rica en arabinoxilanos (AX) atenúa los niveles de glucemia postprandial en sujetos sanos, con intolerancia a la glucosa y diabéticos. En cambio, Mohlig y sus colaboradores no encontraron ningún efecto sobre la respuesta de la glucosa cuando se alimentó a sujetos humanos sanos con panecillos suplementados con AX. Los estudios en animales también han informado de resultados contradictorios sobre el efecto de la suplementación con AX. Los mecanismos subyacentes siguen sin estar claros, pero se supone que las fibras solubles aumentan la viscosidad del lumen, retrasando así la absorción de nutrientes. La viscosidad aparente de las soluciones de AX se ve afectada por la conformación asimétrica y el peso molecular de los AX, así como por la concentración de polímero. De estos tres factores, la concentración de AX parece ser la que más influye en la viscosidad. Así pues, el efecto de los AX sobre la glucosa en sangre depende de la dosis. La viscosidad aparente de las soluciones de AX también depende de la tensión de cizallamiento, de modo que un mayor cizallamiento provoca un adelgazamiento por cizallamiento, el comportamiento característico de los fluidos no newtonianos. Estudios recientes sugieren que el efecto de la viscosidad del AX puede verse compensado por un fuerte peristaltismo intestinal.
La estructura molecular del AX es compleja y heterogénea. Los AX están formados por la espina dorsal del xilano formada por residuos de β-D-xilopiranosilo (Xylp) enlazados con residuos de α-L-arabinofuranosilo (Araf) unidos a la espina dorsal del xilano en las posiciones C(O)-2 y C(O)-3 y/o en ambas posiciones C(O)-2 y C(O)-3 . Los residuos de xilosa también pueden ser sustituidos por enlaces de ácido glucurónico y/o ácido metilglucurónico . Los residuos de ácido ferúlico o cumárico están ligados por éster a los residuos de arabinosa en la posición C(O)-5 . La relación entre la arabinosa y la xilosa, el patrón de sustitución de la arabinosa, el grado de feruloilación y el peso molecular varían mucho entre los cereales y dentro de ellos. Los arabinoxilanos (AX) constituyen la mayor proporción de fibra dietética en los granos de cereales (60-70%) y su contenido varía según la fuente o la fracción del grano. Los AX representan el 1,3-2,7% en peso del trigo. La aleurona y el pericarpio del trigo contienen 20 y 45% de AX, respectivamente. Gran parte de los AX del trigo son insolubles en agua (70-86%).
Los hidratos de carbono digeribles en la dieta se hidrolizan en azúcares monoméricos, glucosa o fructosa, antes de su absorción en el tracto gastrointestinal. El almidón es digerido principalmente en maltosa y otros carbohidratos de cadena corta por la amilasa salival y pancreática. Los resultantes (maltosa, maltotriosa y dextrinas α-limitadas) y la sacarosa son digeridos a glucosa o fructosa por las α-glucosidasas del borde en cepillo del intestino delgado (maltasa-glucoamilasa y sacarasa-isomaltosa) . La absorción de azúcar en el intestino delgado implica principalmente a los transportadores GLUT2, GLUT5 y SGLT1. Así, la disminución de la hiperglucemia postprandial puede conseguirse limitando la digestión o la captación intestinal de carbohidratos. A pesar de las enormes diferencias en la estructura de los AX, la mayoría de los estudios informan con muy poco o ningún detalle de la composición o estructura de los AX utilizados, lo que dificulta la comparación de los resultados sobre el efecto de los AX en la glucemia postprandial. También existen datos muy limitados sobre el efecto de los AX extraíbles en agua purificada sobre las enzimas digestivas de los carbohidratos. Por lo tanto, en este estudio nos propusimos investigar (a) el efecto de los AX sobre las actividades de la α-amilasa y la α-glucosidasa, (b) la influencia de la composición química de los AX sobre su potencia de inhibición, y (c) la cinética de la inhibición de las enzimas.
2. Materiales y métodos
2.1. Productos químicos y reactivos
Una aleurona de trigo comercial (aleurona de trigo Grainwise) fue un regalo de Cargill Limited y Horizon Milling (Wichita, Kansas, Estados Unidos). Consta de 4,5, 15,2, 7,4 y 2,5% de lípidos, proteínas, cenizas y almidón, respectivamente. El salvado de trigo rojo duro de invierno se adquirió localmente en Bulk Barn (Winnipeg, Manitoba, Canadá). Su contenido de humedad, cenizas y proteínas se analizó en 5,8, 5,3 y 11,1%, respectivamente. El almidón de trigo no modificado, la maltosa, la sacarosa, la acarbosa, la α-amilasa del páncreas porcino (EC 3.2.1.1, tipo VI-B), la amiloglucosidasa (EC 3.2.1.3) de aspergillus, y los polvos de acetona intestinal de rata se compraron a Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI, USA). El sulfato de amonio, todos los ácidos y los disolventes orgánicos se compraron a Fischer Scientific (Whitby, Ontario, Canadá). El kit de ensayo de maltosa, sacarosa y glucosa (K-MASUG 08/13) se compró a Megazyme International Ireland (Bray, Wicklow, Irlanda). Todos los productos químicos utilizados eran de grado analítico o HPLC.
2.2. Preparación de arabinoxilano extraíble en agua
Las enzimas endógenas se inactivaron hirviendo muestras de salvado de trigo y de aleurona de trigo (~200 g) en 2 L de etanol acuoso (80%, v/v) a 85°C bajo reflujo durante 2 horas. El sobrenadante se descartó y el residuo se secó al aire en una campana de humos durante una noche a temperatura ambiente. Las fracciones extraíbles en agua se aislaron del salvado o de la aleurona (150 g) secados al aire a 45°C según el método descrito por Izydorczyk y Biliaderis. El extracto acuoso se desarchivó con α-amilasa (1821 U/L) y se desproteinizó con celita y tierra de batán. El material purificado se fraccionó por precipitación de sulfato de amonio (AS) graduado y se obtuvieron fracciones al 50 y al 75% de saturación de AS. El material recogido se liofilizó tras ser dializado (membrana de corte de 12 kDa) durante 48 horas. Las fracciones extraíbles en agua recogidas de la aleurona de trigo se etiquetaron (WA) seguidas de la concentración de AS a la que se obtuvieron (WA-f50 y WA-f75). Del mismo modo, los materiales recogidos del salvado de trigo (WB) se designaron como WB-f50 y WB-f75. Las descripciones químicas y estructurales de las fracciones de WEAX se presentan en la Tabla 1.
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| Valores presentados como media ± desviación estándar (). Un-Xylp: residuos de xilosa no sustituidos, mono-Xylp: residuos de xilosa monosustituidos, di-Xylp: residuos de xilosa disustituida O-2 y O-3.WA-f50 y WA-f75: fracciones extraíbles en agua de WA obtenidas a una saturación de sulfato de amonio del 50 y 75%, respectivamente. WB-f50 y WB-f75: fracciones extraíbles en agua de WB obtenidas a una saturación de sulfato de amonio del 50 y el 75%, respectivamente. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.3. Ensayo de inhibición de la actividad α-amilasa
El almidón de trigo (300 mg) se suspendió en 15 mL de tampón de fosfato de sodio (pH 6,9, 0,1 M) que contenía 1 mM de cloruro de calcio y se coció a 95°C durante 15 minutos . Las fracciones de WEAX (40 mg) se disolvieron en 2 mL de tampón de fosfato de sodio. Las muestras se diluyeron de forma que la concentración final en la mezcla de reacción fuera de 0,0, 0,2, 0,3 y 0,5% (p/v). Se mezclaron volúmenes iguales (200 μL) de almidón y WEAX (o control) y se agitó en vórtex. La hidrólisis del almidón se inició añadiendo 70 μL de α-amilasa pancreática porcina (130 U/mL) y 40 μL de amiloglucosidasa fúngica (240 U/mL). La reacción se detuvo después de 30 minutos calentando a 95°C durante 5 minutos. La mezcla se enfrió inmediatamente en hielo y se centrifugó (Thermo Scientific, Sorvall Legend Micro21, Alemania). Se recogieron los sobrenadantes y se analizó la glucosa con el kit de prueba de glucosa Megazyme. Los estudios de intervención en humanos han informado de la eficacia de una concentración de 0,25 a 0,70% de AX y de ahí nuestra elección del rango de concentración.
2.4. Ensayo de inhibición de la actividad de la α-glucosidasa intestinal de rata
Se utilizó el método de inhibición de la α-glucosidasa de Oki et al. con modificaciones. Brevemente, se mezcló polvo de acetona intestinal de rata (500 mg) con 10 mL de tampón de fosfato de sodio (pH 6,9, 0,1 M) y se sonicó en baño de hielo durante 30 segundos (12 veces) con 15 segundos de pausa para evitar la acumulación de calor. La mezcla se centrifugó posteriormente a 10000 a 4°C durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se etiquetó la α-glucosidasa intestinal de rata. Las muestras de WEAX (40 mg) se disolvieron en 2 mL de tampón fosfato de sodio (pH 6,9, 0,1 M). Posteriormente, se mezclaron 50 μL de α-glucosidasa intestinal de rata con 100 μL de muestra o de tampón (control) y se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Se añadieron 50 μL de 20 mM de sacarosa o 4 mM de maltosa y se incubaron de nuevo durante 60 minutos (sacarosa) o 30 minutos (maltosa). La concentración final de la fracción WEAX fue de 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 y 0,0% (p/v). La actividad de la enzima se detuvo por calentamiento a 95°C durante 10 minutos. Después de la centrifugación a 10000 durante 10 minutos, los sobrenadantes se recogieron para el análisis de la glucosa utilizando el kit de prueba de glucosa Megazyme GOPOD. El % de inhibición de la alfa glucosidasa (sacarasa o maltasa) se calculó como . El valor IC50 se determinó a partir del gráfico del % de inhibición de la α-glucosidasa frente a la concentración de la muestra. También se realizó la inhibición de la α-glucosidasa intestinal de rata con acarbosa (un conocido inhibidor de la α-glucosidasa) con fines de comparación. Se utilizaron concentraciones de acarbosa de 1,625, 3,25, 4,9, 6,5, 9,8 y 13 μg/mL en lugar de la muestra.
2,5. Análisis estadístico
Todos los análisis se realizaron por sextuplicado (a menos que se indique lo contrario) y todas las estadísticas se calcularon utilizando un análisis de varianza (ANOVA) de una vía en un software estadístico JMP 12 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Las medias de las muestras se compararon mediante el método HSD de Tukey y se determinaron las diferencias significativas a . Las correlaciones entre los parámetros se calcularon mediante la prueba de correlación de Pearson.
3. Resultados y discusión
Los efectos de WEAX en la hidrólisis del almidón se presentan en la figura 1. Se comparó la cantidad de glucosa liberada durante 30 minutos de incubación con α-amilasa en presencia o ausencia de fracciones WEAX. La adición de fracciones WEAX disminuyó numéricamente la cantidad de glucosa producida en comparación con el tratamiento de control. Sin embargo, las comparaciones estadísticas de los grupos de tratamiento y el control mostraron que la diferencia media no era significativa () para WA-f50, WA-f75 y WB-f75 independientemente de la concentración de WEAX. La presencia de 0,5% de WB-f50 dio lugar a una disminución significativa de la amilolisis en comparación con el control (). Sin embargo, nuestras observaciones para la actividad de la alfa amilasa contrastaron con otros informes en la literatura, posiblemente debido a la concentración y el tipo de AX. La amilolisis del almidón se realizó en presencia de 1 y 2% de AX y el AX utilizado carecía de ácido ferúlico. Se utilizaron concentraciones de AX (~5-10 g) equivalentes a las que se han notificado para atenuar la glucosa en sangre postprandial en estudios en humanos.
La tabla 2 muestra el efecto del WEAX sobre la actividad de la α-glucosidasa en presencia de sacarosa o maltosa como sustrato. Los datos se presentan como IC50, que es la concentración del inhibidor que produce una inhibición del 50% de la actividad de la α-glucosidasa. Los valores de la IC50 oscilaron entre 4,88 y 10,14 mg/mL contra la actividad de la α-glucosidasa con maltosa como sustrato. Sin embargo, no se observó ninguna inhibición cuando se utilizó sacarosa como sustrato. La potencia inhibitoria de WEAX contra la maltasa intestinal fue 1000-2000 veces menor en comparación con la acarbosa (un control positivo). Existe la hipótesis de que la viscosidad puede ser la causa del efecto del AX sobre la glucosa postprandial. Así, Vogel et al. alimentaron a ratas con un AX de salvado de trigo modificado para estudiar el efecto de la viscosidad . Además, la inhibición de la alfa glucosidasa intestinal por el mono/oligosacárido AX también se relacionó con su fracción de ácido ferúlico. Por lo tanto, WA-f50 y WB-f75 tenían una potencia de inhibición significativamente diferente hacia la actividad de la α-glucosidasa a pesar de tener proporciones relativas similares de residuos de xilosa no sustituidos (un-Xylp), monosustituidos, (2-Xylp o 3-Xylp), y disustituidos (2,3-Xylp) y grado de sustitución, pero diferente contenido de ácido ferúlico.
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| Los datos representan los valores del coeficiente de correlación de Pearson en . un-Xylp: residuos de xilosa no sustituidos, mono-Xylp: residuos de xilosa monosustituidos, di-Xylp: residuos de xilosa disustituidos C (O)-2 y C (O)-3. | ||||||||||||||||||||||||||
La relación entre la arabinosa y la xilosa es una medida del grado de sustitución (DS). Se observó una fuerte asociación lineal negativa ( = -0,67) entre el DS y el IC50. Esto podría ser consecuencia de una mayor solubilidad de la AX debido a un alto DS. Así, el WEAX altamente sustituido parece tener un valor de IC50 más bajo (alta potencia de inhibición). La misma observación fue apoyada por la asociación negativa entre la potencia de inhibición y la proporción relativa de residuos de xilosa no sustituidos. La relación aparente entre los residuos de dixilo y monoxilo no parece tener influencia, pero el grado de sustitución de la xilosa mostró un efecto. Por lo tanto, es probable que el efecto sobre la actividad de la α-glucosidasa pueda emanar de los residuos de arabinosa de WEAX. Se ha informado de que la arabinosa inhibe la actividad de la α-glucosidasa. Los intentos de eliminar los residuos de arabinosa de WEAX utilizando arabinofuranosidasa no tuvieron éxito para demostrar la hipótesis. Sin embargo, observamos que el mono-xilo en C (O)-2 era un factor determinante en comparación con el mono-xilo en C (O)-3, lo que sugiere que la potencia de inhibición iba más allá de la mera presencia del residuo de arabinosa. Hubo una fuerte correlación entre el mono-Xil en C (O)-2 y el contenido de ácido ferúlico ( = 0,99). Por lo tanto, es posible que la influencia observada de la DS se haya derivado de la del ácido ferúlico.
Se utilizó el gráfico de Lineweaver-Burk (Figura 2) para calcular la velocidad máxima aparente () y la constante de Michaelis-Menten () para la actividad de la α-glucosidasa sobre la maltosa en presencia y ausencia de WEAX. El efecto de la fracción WEAX sobre y se analizó para determinar el tipo de inhibición. y de la α-glucosidasa para la maltosa en ausencia de fracciones WEAX fueron 17,5 μg de glucosa por minuto y 5,99 mM, respectivamente. La Tabla 4 muestra que la adición de las fracciones de WEAX disminuyó ambos valores, lo que sugiere que WEAX inhibió la actividad de la α-glucosidasa a través de un modo no competitivo. Una característica típica de la inhibición no competitiva es que ambos y disminuyen en presencia del inhibidor. Por lo tanto, es plausible que las fracciones de WEAX se unan al complejo enzima-sustrato, disminuyendo así tanto y . También se encontró que la arabinosa inhibe la actividad de la α-glucosidasa a través de un modo no competitivo .
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| Valores presentados como media ± desviación estándar (). Los datos en la misma columna con el mismo superíndice no son significativamente diferentes a . = velocidad máxima; es la constante de Michalelis-Menten (concentración de sustrato necesaria para que una enzima alcance la mitad ). nd significa no determinado. WA-f50 y WA-f75: fracciones extraíbles en agua de WA obtenidas al 50 y al 75% de saturación de sulfato de amonio, respectivamente. WB-f50 y WB-f75: fracciones extraíbles en agua de WB obtenidas al 50 y al 75% de saturación de sulfato de amonio, respectivamente. | |||||||||||||||||||||||||||
Nuestros resultados pueden proporcionar una explicación sobre la inconsistencia observada en la literatura sobre el efecto de AX en el nivel de glucosa postprandial. La alimentación de ratas diabéticas de Zuker con pan suplementado con AX (Ara/Xyl = 0,9) dio lugar a una disminución significativa del nivel de glucosa en sangre postprandial . En cambio, la ingesta de AX nativo (Ara/Xyl = 0,5) no tuvo ningún efecto sobre la respuesta de la glucosa en sangre . Asimismo, la suplementación de las dietas con 6 y 12 g de AX (Ara/Xyl = 0,66 o 0,8) redujo la glucosa en sangre tanto en sujetos sanos como diabéticos . Sin embargo, AX (Ara/Xyl = 0,8) no atenuó la respuesta postprandial de la glucosa en adultos humanos sanos . Los cerdos alimentados con pan blanco suplementado con AX tuvieron un flujo neto de glucosa reducido en comparación con los cerdos alimentados con pan blanco . La ausencia de una composición química y estructuras detalladas dificulta la comparación de los resultados sobre la eficacia de los AX . Así, aunque las concentraciones de AX utilizadas sean las mismas, su eficacia dependería de la naturaleza de los AX utilizados. Hemos demostrado que los AX obtenidos al 50% de saturación de sulfato de amonio mostraron una mayor potencia de inhibición en comparación con los AX obtenidos al 75%.
4. Conclusión
Los resultados de este estudio indicaron que el efecto antiglicémico de los arabinoxilanos puede derivarse de la inhibición de la actividad de la α-glucosidasa intestinal pero no de la actividad de la amilasa. La potencia del AX extraíble en agua sobre la actividad de la α-glucosidasa se vio influida por el contenido de ácido ferúlico, la proporción de arabinosa a xilosa y el patrón de sustitución de la xilosa. Los resultados también sugieren que la inhibición de la actividad de la α-glucosidasa se produce a través de un mecanismo no competitivo. Por lo tanto, el consumo de una dieta rica en AX extraíble en agua puede atenuar el nivel de glucosa en sangre postprandial.
Divulgación
Parte de los resultados se presentó como póster oral en el simposio de Investigación de Alimentos Funcionales y Productos Naturales para la Salud (FFNHP)/Aplicaciones Terapéuticas de Alimentos Funcionales y Bioactivos (TAFFB) celebrado en el Centro de Investigación Albrechtsen del Hospital St-Boniface del 20 al 22 de abril de 2016.
Conflictos de intereses
Todos los fondos o apoyos materiales recibidos no dieron lugar a conflictos de intereses en la publicación de este manuscrito.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) a través del Programa de Subvenciones de Descubrimiento. Los autores también agradecen a Cargill Limited el suministro de muestras de aleurona de trigo y a Ce Zhou, Alison Ser y Pat Kenyon del Departamento de Ciencias de la Alimentación de la Universidad de Manitoba, por su apoyo técnico.