El dominio del polo animal del erizo de mar es un centro neurogénico dependiente de Six3 | Desarrollo

Para identificar los genes reguladores tempranos de la APD, comparamos las concentraciones relativas de los ARNm individuales en los embriones inyectados con ARNm de la cadherina Δ frente a los inyectados con glicerol en la fase de eclosión de la blástula utilizando un microarray que representa todas las predicciones genéticas encontradas en la secuencia del genoma del erizo de mar (Wei et al., 2006). Esta etapa marca la transición entre la escisión y el inicio de la morfogénesis y es poco después del momento en que se han detectado los primeros marcadores de la DPA (Burke et al., 2006; Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008). Se identificó un conjunto de genes que codifican factores de transcripción y componentes de vías de señalización con una expresión media de al menos 3 veces mayor en dos lotes de embriones inyectados con ARNm de cadherina. Estos genes coinciden parcialmente con el conjunto de genes candidatos identificados por el método bioinformático. Los conjuntos combinados contienen 27 genes y constituyen un conjunto provisional de genes reguladores de APD (E-APD)(Tabla 1).

Con el fin de identificar los genes expresados más tempranamente dentro del conjunto E-APD, examinamos los perfiles de expresión temporal generados por microarrays como se ha descrito anteriormente (Wei et al., Los patrones se verificaron mediante la comparación con los datos publicados (Burke et al., 2006; Croce et al., 2006; Howard-Ashby et al., 2006a; Howard-Ashby et al., 2006b; Materna et al., 2006; Sweet et al., 2002; Takacs et al., 2004; Tu et al., 2006; Yaguchi et al., 2008) y mediante nuestras hibridaciones in situ de montaje completo (nuestras observaciones no publicadas). Los genes se clasificaron en tres grupos: los representados al máximo en la población de ARN materno (Fig. 2A), los fuertemente regulados durante las etapas de clivaje (Fig. 2B, C) y los regulados entre las etapas de clivaje tardío y gástrula temprana (Fig. 2D). En primer lugar, nos centramos en los miembros del grupo de expresión embrionaria temprana. Como se muestra a continuación, utilizando ensayos de pérdida y ganancia de función, identificamos uno, Sp-Six3 (en adelante Six3), que opera en o cerca de la parte superior de la jerarquía de regulación de APD.

Six3 se expresa tempranamente en el APD

La identificación de six3 del erizo de mar es inequívoca porque su secuencia está muy conservada en el homeodominio (98% idéntico aHsSix3), el dominio six (91%) y el dominio de interacción groucho (71%) (verFig. S1 en el material suplementario). Confirmamos estudios anteriores que mostraban que Six3 se expresa en un patrón dinámico durante el desarrollo de Paracentrotus lividus (Poustka etal., 2007), una especie estrechamente relacionada con Strongylocentrotuspurpuratus utilizada en este estudio. Los rasgos más importantes son que los transcritos de Six3 se expresan en el hemisferio animal durante el levante tardío (Fig. 3A), en el APD en la etapa de blástula eclosionada (Fig.3B) y luego en dos anillos (Fig.3G,H), uno cerca de la periferia del APD (Fig. 3C-F,H) y el otro en el endomesodermo (Fig. 3C-G), durante las etapas de blástula del mesénquima. Durante la gastrulación, Six3 se expresa en algunas células del mesénquima secundario dispersas por elblastocoel y en la punta del arquenteron(Fig. 3I, flecha), como informaron Howard-Ashby et al. (Howard-Ashby etal., 2006b), en células del polo animal(Fig. 3I,J) y en el ectodermo oral(Fig. 3J,K). En el estadio de plúteo, el ARN de Six3 se detecta en dos grupos de células que flanquean la boca (Fig. 3K, flechas) y en la banda ciliada (Fig. 3K).

Los niveles globales de ARNm de Six en el estadio de blástula del mesénquima temprano no cambian significativamente al inyectar ARNm de cadherina (Tabla 1). Las hibridaciones in situ son consistentes con este resultado y muestran que la distribucióndifiere en los embriones inyectados con ARNm de Δcadherina, estando ausente de las células vegetales y conservando la amplia expresión del hemisferio animal que se establece antes de la restricción por procesos dependientes de Wnt canónico (ver Fig. S2 en el material suplementario).

La función de Six3 es necesaria para la formación de APD y la diferenciación de las neuronas

Para comprobar la función de Six3, inyectamos en óvulos fecundados dos morfolinos diferentes que bloqueaban la traducción de Six3, cada uno de los cuales provocaba los mismos defectos de desarrollo. Los embriones a los 3 días adoptaron una morfología redondeada (Fig. 4A,B) y las espículas estaban reducidas o ausentes. El ectodermo del polo animal carecía de la morfología epitelial engrosada característica de la placa animal (Fig. 4, comparar A,B con C,paréntesis). En algunos lotes de embriones, la gastrulación se produjo con normalidad, aunque se retrasó, y la posición del arquenteron mostró que se estableció la polaridad oral/aboral (Fig.4A). En otros lotes, la mayoría de los embriones exogastraron. En los embriones que carecían de Six3, la diferenciación neural estaba fuertemente inhibida, como se comprobó mediante la inmunotinción de los marcadores neurales que se expresan normalmente durante los estadios de lategástrula y plúteo (Fig.4, comparar A,B con C). La mayoría (2/3) de los embriones contenían neuronas noserotonérgicas y el resto tenía un número reducido (Fig. 4D) en comparación con el número normal en esta etapa (3-5). Lo mismo ocurrió con todas las demás neuronas, analizadas por el marcador pan-neural sinaptotagmina (1e11) (Fig. 4A,B), que se encuentran en la banda APD y ciliada de los embriones normales de 3 días (Fig. 4C). Significativamente, la expresión de hbn se redujo a un nivel indetectable por hibridación in situ (Fig. 4F frente a Fig. 4E). Las mediciones de QPCR confirmaron esta observación y mostraron que los niveles de ARNm de hbn yfoxq2, que marcan los límites exteriores y las porciones interiores de la APD, respectivamente, se redujeron entre 8 y 10 veces en los morfantes Six3 en la fase de blástula temática (Fig.5).

Six3 es necesario para la expresión de la mayoría de los genes en el conjunto de EAPD

El llamativo fenotipo producido por la pérdida de Six3, así como su temprana expresión en el embrión, sugirió que podría funcionar cerca de la parte superior de la red reguladora de genes de APD. Para examinar esta posibilidad más a fondo, utilizamos el análisis de microarrays para buscar genes dependientes de Six3 a las 27 horas, el momento en que los genes del conjunto E-APD se acercan a los niveles máximos de expresión. Para eliminar las funciones endomesodérmicas de Six3, realizamos esta búsqueda en embriones inyectados con cadherina. Como se muestra en la Fig. 5A, la pérdida de Six3 en estos embriones eliminó por completo el desarrollo de todo el exceso de neuronas encontrado en los embriones inyectados con Δcadherina y no se formó ningún epitelio engrosado, demostrando de nuevo un papel importante para Six3 en el desarrollo de la APD. Los datos del microarray identificaron un número sorprendentemente grande de predicciones de genes (682) que estaban fuertemente regulados a la baja (al menos 4 veces) en embriones doblemente inyectados con ARNm de cadherina y Six3-MO, en comparación con embriones inyectados sólo con ARNm de cadherina. Además, más del 60% de todos los genes en la pantalla de microarrays anterior que fueron regulados al menos 3 veces en embriones inyectados con ARNm de cadherina, y por lo tanto es probable que se expresen en el APD, fueron significativamente regulados por la pérdida de Six3. Es importante destacar que los datos del microarray indicaron que la mayoría de los genes de la EAPD eran sensibles a Six3 (Fig. 5B, amarillo). De acuerdo con esto, las mediciones de QPCR en otros dos lotes de embriones mostraron que sólo 5 genes E-APD no dependían significativamente de Six3 (Fig. 5B, rojo, azul).

La sobreexpresión de Six3 es suficiente para expandir la APD

Estos resultados apoyan fuertemente la idea de que Six3 funciona temprano en las redes de regulación de los genes de la APD, y plantean la posibilidad de que pueda ser suficiente para inducir a otras células en el embrión a adoptar destinos de APD.La misexpresión de Six3 dio lugar a embriones que muestran un cambio extraordinario en la morfología. Una banda en forma de herradura de células densamente empaquetadas se extendía en dirección vegetal desde el polo animal (Fig. 6, comparar B,C con A). Las neuronas serotoninérgicas, normalmente restringidas a la placa animal (Fig. 6D), se multiplicaron por 4 y se distribuyeron a lo largo de la banda densa (Fig. 6G). Además, las formas columnares y la disposición de las proyecciones neuronales en las células que contienen sinaptogmina (1e11) son similares a las de la placa animal de los embriones de control (Fig. 6E, cuadro blanco discontinuo frente a la Fig.6H). Todas estas células contienen en sus núcleos NK2.1 (Fig. 6J-M, verde), un factor de transcripción que se expresa normalmente en la placa animal y en el ectodermo supraoral adyacente (Fig. 6I, I′; círculos verdes en la Fig. 6U), así como en algunas células del intestino anterior (Takacs et al., 2004). Una cadena de células neuronales 1e11-positivas divide la banda (Fig. 6K, rojo) y las células del lado interior de la banda NK2.1-positiva también expresan Gsc (Fig. 6L,N, rojo). La combinación de NK2.1 y Gsc marca de forma exclusiva el epitelio facial supraoral en el borde oral de la placa animal (Fig.6I,I′, células amarillas yFig. 6U, círculos amarillos). Las células columnares densamente empaquetadas de la banda expandida rodean células epiteliales más aplanadas que expresan NK2.1, pero no Gsc(Fig. 6M,N), al igual que las células de las regiones superiores de la boca de los embriones normales(Fig. 6I, boca, m). Otra prueba de que estas células son similares a las que se encuentran cerca de la boca de los embriones normales es que expresan ARNm de hbn, que, en los embriones normales de 3 días, se acumula alrededor del margen de la placa animal y se extiende hacia el ectodermo supraoral (Fig. 1, Fig. 6O). En los embriones que expresan Six3, las células positivas para hbn se concentran en el epitelio delgado del polo vegetal y, por lo tanto, se sitúan en la misma posición con respecto a la placa animal expandida y a las células positivas para Nk2.1 en el intestino anterior superior que en los embriones normales (Fig. 6P, Q). El lado opuesto a la región oral se diferencia como un epitelio escamoso fino, expresa el marcador de ectodermo aboral, Spec1 (Fig. 6R-T) y puede corresponder a la franja de ectodermo aboral positiva para hbn adyacente a la placa animal. En conjunto, estos patrones de expresión génica llevan a la notable conclusión de que Six3 es suficiente para reespecificar los destinos de las células en la mayor parte del resto del embrión, generando un embrión de 3 días que consiste en un dominio del polo animal muy expandido, pero correctamente modelado, con polaridad oral/aboral. El APD en los embriones normales y en los que expresan Six3 está marcado por los círculos azules en la Fig. 6U.