El fungicida azoxistrobin promueve la dominación de las cianobacterias de agua dulce a través de la alteración de la competencia

Toxicidad del AZ sobre algas verdes y cianobacterias

Se utilizó la cianobacteria modelo M. aeruginosa así como un alga verde común C. pyrenoidosa se utilizaron para investigar la toxicidad del AZ sobre las algas verdes y las cianobacterias. El crecimiento de M. aeruginosa no fue suprimido por el rango de concentraciones de AZ durante el tratamiento de 7 días (Fig. 1a), mientras que el crecimiento de C. pyrenoidosa fue inhibido por aproximadamente 9,2-30% en las tres concentraciones de AZ probadas después de 7 días (Fig. 1a). El crecimiento de C. pyrenoidosa en presencia de una baja concentración de AZ (5-10 μg L-1) y con una baja densidad inicial de células de algas (alrededor de 20.000 células/mL, cercana a la densidad de algas en la naturaleza), que son condiciones representativas de los entornos contaminados de forma natural, se inhibió significativamente en un 20~30% (archivo adicional 1: Figura S2) (p < 0,05), mientras que el crecimiento de M. aeruginosa no se vio afectado en las mismas concentraciones de AZ probadas. Estudios de laboratorio anteriores también mostraron que los efectos tóxicos inhibitorios de AZ variaban drásticamente entre las algas verdes y las cianobacterias; por ejemplo, la toxicidad de AZ disuelta en el crecimiento de la clorofita Pseudokirchneriella subcapitata fue casi 500 veces mayor que la reportada en la cianobacteria Anabaena flos-aquae .

Se utilizaron microcosmos para estudiar los efectos del AZ en la comunidad del plancton. Los microorganismos se separaron del agua natural del lago por filtración y se transfirieron a un medio artificial, tras lo cual se añadió a los microcosmos un rango de concentraciones de AZ. Se midieron las concentraciones de Chl-a y ficocianina en los microcosmos tras el tratamiento con AZ. La concentración de Chl-a, que estima la biomasa total de fitoplancton, alcanzó 4 mg L-1 en los microcosmos de control después de 3 días de cultivo en el medio y se produjo una floración de fitoplancton (Fig. 1b). La exposición a una concentración de AZ superior o igual a la menor concentración probada (0,5 mg L-1) durante 3 días disminuyó la concentración de Chl-a, lo que indica que la AZ puede tener efectos tóxicos sobre las poblaciones de fitoplancton que componen las algas verdes (Fig. 1b). La concentración de Chl-a disminuyó entre un 8,7% y un 37,3% en el rango de concentraciones de AZ probadas en los microcosmos. Por el contrario, la producción de otro pigmento, la ficocianina, que se utilizó como indicador de la biomasa de cianobacterias, aumentó tras la exposición de 3 días a concentraciones de AZ superiores o iguales a 2,5 mg L-1 (Fig. 1c), lo que sugiere que la AZ favoreció el crecimiento de las cianobacterias en el microcosmos.

La tasa de descomposición de la azoxistrobina en el medio acuático es estimulada por la luz y la AZ tiene un DT50 (tiempo hasta el 50% de disipación) de fotólisis acuosa (pH 7) entre 8,7 y 13,9 días . Curiosamente, las concentraciones de AZ disuelta disminuyeron de forma diferente en el tiempo en respuesta a las algas verdes y a las cianobacterias; disminuyendo más rápidamente en los cultivos de C. pyrenoidosa que en los de M. aeruginosa (Fig. 1d). Esto indica que el alga eucariota C. pyrenoidosa tomó más AZ disuelta que M. aeruginosa, aunque fueron inoculadas a la misma densidad óptica. El agotamiento de la concentración de AZ disuelta en los microcosmos fue también más rápido que en los cultivos de M. aeruginosa (Fig. 1d). El agotamiento de AZ en los microcosmos podría explicarse por la captación/adsorción preferencial de AZ en el alga verde (el componente principal en los microcosmos) así como por la mayor adsorción de AZ en otros microorganismos acuáticos excepto las cianobacterias. Los resultados anteriores sugieren que C. pyrenoidosa fue mucho más sensible a AZ que M. aeruginosa, probablemente debido en parte a un mayor consumo de AZ (captación/adsorción) en C. pyrenoidosa.

Variación de las proporciones de transcripción tras la exposición a AZ en toda la comunidad de plancton

Secuenciación meta-transcriptómica se llevó a cabo para investigar los cambios en la transcripción de toda la comunidad de plancton tras la exposición a AZ. Un resumen de los resultados de la secuenciación meta-transcriptómica se proporciona en el archivo adicional 1: Resultados extendidos. Las proporciones taxonómicas de las transcripciones en dos grupos a diferentes niveles taxonómicos se muestran en el archivo adicional 2: Dataset 2, que fueron representados por la abundancia relativa de transcripciones taxonómicamente anotados (RAT). El valor de RAT no representa la biomasa microbiana, sino los cambios en la actividad transcripcional entre las especies, que representa los estados metabólicos activos y las funciones de la comunidad microbiana.

La abundancia relativa de RAT en los microcosmos de control después de 7 días de cultivo fue controlada principalmente por Monoraphidium sp. (un género Chlorophyta) (Fig. 2). Sin embargo, la abundancia relativa de RAT de Chlorophyta disminuyó de 63.6% en el control a 35.8% en los microcosmos tratados con AZ (Fig. 2a, Archivo Adicional 1: Tabla S2) a pesar de que el recuento de transcritos taxonómicos de las principales clases dentro del filo Chlorophyta no se vio muy afectado por el tratamiento con AZ (Fig. 2c). La abundancia relativa de RAT de otras especies de algas eucariotas entre las Phaeophyceae y Eustigmatophyceae también disminuyó significativamente en los microcosmos tratados con AZ (p < 0,05), mientras que la abundancia de Bacillariophyta aumentó en ~ 6 veces (Archivo adicional 1: Tabla S2). Mientras tanto, la RAT de las cianobacterias (principalmente compuestas por Synechococcales) aumentó dramáticamente en más de 20 veces, es decir, del 1,7% en el grupo de control al 38,3% en el grupo de AZ. La relación de abundancia de secuencias de eucariotas/procariontes disminuyó de 3,1 a 0,9 (Fig. 2b) en los microcosmos tratados con AZ, debido principalmente al drástico aumento de las cianobacterias y a la disminución de las clorofitas, respectivamente. El aumento de las Cianobacterias en los microcosmos tratados con AZ estuvo unido a una mayor proporción de Synechococcales y a una menor proporción de Chroococcales (Fig. 2d), mientras que AZ no afectó a la abundancia relativa de los órdenes dentro de la Chlorophyta, la principal división eucariótica (Fig. 2c). Las cianobacterias dentro del orden Synechococcale pueden formar floraciones tóxicas, afectando potencialmente a los competidores de las algas eucariotas.

AZ inhibe tanto a Monoraphidium sp. como a Synechococcus sp. en monocultivos

Como la RAT de Monoraphidium sp. se redujo a la mitad y la RAT de Synechococcus sp. aumentó considerablemente después del tratamiento con AZ, se llevaron a cabo bioensayos de toxicidad de AZ en cultivos por lotes de laboratorio de Synechococcus sp. y Monoraphidium sp. para reforzar nuestra hipótesis de que la adición de AZ en los microcosmos podría beneficiar preferentemente a una cianobacteria (Synechococcus sp.) sobre un competidor de algas verdes (Monoraphidium sp.). Curiosamente, el crecimiento de monocultivos de Synechococcus sp. en medio BG-11 como inhibido en ~ 28% después de 7 días (Fig. 3a) (p < 0,05) a una concentración inicial de AZ de 2,5 mg L-1, aunque no fue significativamente influenciado después de 4 días de exposición (p = 0,21), lo que indica que el crecimiento de Synechococcus sp. podría ser inhibido por la exposición a largo plazo a altas concentraciones de AZ. Por el contrario, el crecimiento de Monoraphidium en los cultivos monoalgales de laboratorio fue siempre inhibido durante todo el proceso de cultivo; con un rendimiento celular inhibido en ~ 45% después de 7 días de exposición a 2,5 mg L-1 de AZ (concentración inicial) (Fig. 3b). Los resultados anteriores indican que Monoraphidium sp. es más sensible a la AZ que Synechococcus sp. Debido a la notable ventaja de crecimiento de Synechococcus sp. en los microcosmos tratados con AZ (Fig. 2d), parece que AZ juega un papel indirecto en el beneficio de Synechococcus sp.

La AZ inhibe a Monoraphidium sp. y beneficia a Synechococcus sp. en los co-cultivos

Cuando se co-cultivaron las dos especies de algas, se encontró que la adición de AZ beneficia a Synechococcus sp. sobre Monoraphidium sp. tanto en el agua filtrada del lago eutrófico (Fig. 3c-f) como en el medio BG-11 modificado (Archivo adicional 1: Figura S3), lo que concuerda con los resultados del análisis meta-transcriptómico de RAT. Después de un cultivo de 7 días en agua de lago eutrófico, la relación del número de células (Synechococcus/Monoraphidium) fue mejorada por el tratamiento con AZ, de 1,2 en el control a 2,3, 3,6, o 7,7, para el tratamiento con 25 μg L-1, 250 μg L-1, o 2,5 mg L-1 de AZ, respectivamente (Fig. 3c-f). Los resultados del crecimiento de las algas procariotas y eucariotas en el medio BG-11 modificado (Archivo adicional 1: Figura S3) fueron similares a los del agua del lago eutrófico, donde el Synechococcus sp. gana dominancia en el tratamiento con AZ. Existe un equilibrio entre las algas verdes y las cianobacterias en el agua natural, impulsado por varios factores, como las interacciones alelopáticas y la retroalimentación positiva. La presencia de AZ perturbó este equilibrio, probablemente a través de la alteración del metabolismo de las algas verdes, y estimuló el crecimiento de Synechococcus sp. en relación con el de Monoraphidium sp. en los cocultivos (Fig. 3c-f). Después del tratamiento con AZ, el número de células de Synechococcus sp. aumentó a ~ 1,5 veces en el cocultivo (Fig. 3c-f) mientras que la RAT de Synechococcus sp. aumentó más de 20 veces en el microcosmos en comparación con el control. Dado que la RAT no puede ser fácilmente comparada con la densidad celular, es difícil comparar cuantitativamente los experimentos de laboratorio y de microcosmos. Sin embargo, ambos experimentos sugieren que la AZ favorece el crecimiento de las cianobacterias al alterar la competencia con las algas verdes.

AZ cambia la actividad transcripcional de hongos, virus, bacterias y zooplancton

La RAT de los hongos, incluyendo Zygomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Ascomycota, disminuyó significativamente (p < 0,05) después de la exposición a AZ en comparación con el control (Archivo adicional 1: Tabla S2) debido a la acción fungicida de AZ. Cabe destacar que la RAT del filo Chlorobi, que incluye bacterias fotosintéticas que no producen oxígeno y prefieren ambientes anaeróbicos, también aumentó significativamente (~ 8 veces) (p < 0,05) en los microcosmos tratados con AZ. Aunque la concentración total de oxígeno disuelto (DO) permaneció supersaturada en los microcosmos tratados con AZ en comparación con el control (archivo adicional 1: Figura S4), las microzonas anóxicas que rodean a los agregados microbianos (tal vez cianobacterias) pueden estar bien desarrolladas en los microcosmos tratados con AZ , lo que estaría en consonancia con el aumento de la RAT de Chlorobi. La RAT del zooplancton en la mayoría de los filos, como Arthropoda, Nematoda y Cnidaria, disminuyó bajo la exposición a AZ en relación con el control (Archivo adicional 1: Tabla S2), mientras que lo contrario fue cierto para algunos géneros como Acanthamoeba (Tabla 1). En general, la RAT de algunos zooplancton (como Daphnia, de Arthropoda), hongos (pertenecientes a Chytridiomycota), bacterias heterótrofas (Cytophaga y Bdellovibrio) y virus (Podoviridae, Siphoviridae y Myoviridae) disminuyó significativamente (p < 0,05) en los microcosmos tratados con AZ en comparación con el control (Tabla 1, Fig. 4). Los organismos planctónicos mencionados anteriormente pueden pastar, parasitar o lisar las cianobacterias y jugar un papel en el control de su abundancia y, por lo tanto, podrían explicar en parte el dominio de las cianobacterias en presencia de AZ. Otra posibilidad para la disminución de la abundancia relativa del zooplancton es que estos cambios puedan reflejar la disminución de clorofitas comestibles y el aumento de cianobacterias no comestibles, ya que las clorofitas tienen una mayor sensibilidad a la AZ que las cianobacterias.

También se sabe que las zoosporas de los hongos juegan un papel crítico en la vinculación de las cianobacterias no comestibles y el zooplancton. Los artrópodos (cladóceros o copépodos) son incapaces de sintetizar esteroles de novo y tienen que encontrarlos a partir de su alimento. Por ejemplo, las zoosporas de quítridos son un complemento alimenticio esencial para las Daphnia cuando pastan sobre cianobacterias filamentosas. Dado que el fungicida AZ inhibió fuertemente los hongos y, por tanto, probablemente redujo las zoosporas fúngicas (Tabla 1), es posible que disminuya el pastoreo de Daphnia sobre las cianobacterias, lo que a su vez contribuiría a disminuir el crecimiento de Daphnia (Tabla 1) y a aumentar el crecimiento de las cianobacterias, protegiendo así a las cianobacterias del pastoreo. Ni la comunidad de zooplancton ni los virus y parásitos de las cianobacterias podrían controlar la floración de cianobacterias. Sin embargo, pueden añadir estabilidad al sistema acuático modificando la estructura de la red alimentaria y pueden afectar a la comunidad microbiana, así como contribuir potencialmente a la floración de cianobacterias.

Vías metabólicas en eucariotas y bacterias en respuesta al tratamiento con AZ

Dado que la información de anotación transcriptómica general es limitada en el género Chlorella y otras clorofitas , los análisis meta-transcriptómicos de toda la comunidad microbiana fueron útiles para comprender mejor las interacciones entre los organismos planctónicos y las cianobacterias. Un resumen de la anotación funcional se proporciona en el archivo adicional 1: Resultados extendidos, y la variación funcional detallada se proporciona en el archivo adicional 2: Dataset 3, 4. Distinguimos las secuencias de eucariotas y bacterias y las diseccionamos en el nivel 3 de KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). La figura 5 muestra las 40 vías más importantes basadas en la abundancia relativa de los transcritos (pertenecientes a cuatro sistemas metabólicos mencionados en la sección anterior) en eucariotas y bacterias.

Aunque la proporción de composición de eucariotas no se vio muy afectada por AZ (Archivo adicional 1: Figura S5a), las vías de nivel 3 de KEGG a menudo se vieron afectadas de forma apreciable (Archivo adicional 2: Conjunto de datos 4). Como se muestra en la Fig. 5a, las vías más sobreexpresadas debido a la presencia de AZ en eucariotas fueron la transducción de señales de hormonas vegetales, la vía de señalización MAPK, el metabolismo del nitrógeno, la proteólisis mediada por ubiquitina y el metabolismo de los glicerofosfolípidos, y las vías más infraexpresadas fueron el metabolismo de la porfirina y la clorofila, la fosforilación oxidativa y el peroxisoma, lo que indica que AZ modula la expresión génica funcional en eucariotas.

En respuesta a la floración de cianobacterias, la estructura de la comunidad bacteriana y la abundancia relativa de las vías metabólicas cambiaron drásticamente (Fig. 5b y archivo adicional 1: Figura S5b). Como se muestra en la Fig. 5b, las vías estrechamente relacionadas con las cianobacterias se sobreexpresaron significativamente (p < 0,05), incluyendo la biosíntesis de carotenoides (+ 1326% en comparación con el control), las proteínas de la fotosíntesis-antena (+ 1305%) y la fotosíntesis (+ 758%). También observamos que muchas vías con una baja abundancia relativa (< 0,05) relacionadas con la antibiosis, el metabolismo de las vitaminas y la síntesis de polisacáridos se expresaron de forma diferencial en respuesta a AZ (archivo adicional 2: conjunto de datos 4). Estas funciones se discuten a continuación.

1. Modulación de la fosforilación oxidativa y la fotosíntesis por AZ. El nivel de expresión relativa de los genes relacionados con la fosforilación oxidativa tanto en eucariotas como en procariotas disminuyó drásticamente en los microcosmos tratados con AZ, y el grado de inhibición en los dos reinos fue equivalente, es decir, ~ 42% en comparación con el control. Los genes (atpA, atpB, atpD y atpF) que codifican la enzima F-ATPasa, en las membranas mitocondrial y cloroplástica, se infraexpresaron significativamente tanto en eucariotas como en bacterias (disminuyeron en torno al 40~80%) (p < 0,05). Esta disminución de la transcripción de la F-ATPasa podría explicarse por la acción tóxica del AZ, que inhibe el complejo de transferencia de electrones entre el citocromo b y el citocromo c1, disminuyendo la respiración mitocondrial y la producción de ATP. En cuanto a las vías metabólicas fotosintéticas, la modulación de los transcritos del fotosistema tras el tratamiento con AZ fue diferente entre eucariotas y bacterias (archivo adicional 1: Figura S6). En las bacterias, los genes implicados en el ficobilisoma (por ejemplo, apcD, apcE, cpeC, cpeZ) se sobreexpresaron fuertemente (entre 4 y 32 veces), mientras que en las eucariotas, la transcripción de los genes que codifican las proteínas del complejo recolector de luz (por ejemplo, LHCB2 y LHCA1) permaneció prácticamente sin cambios (archivo adicional 2: conjunto de datos 5). Esto coincide con el aumento de cianobacterias en los microcosmos tratados con AZ. Sin embargo, vale la pena señalar que las bacterias pueden tener mecanismos de desintoxicación de AZ para disminuir la toxicidad de AZ mediante un fuerte aumento (en alrededor de 10-24 veces) de los genes NAD(P)H-quinona oxidorreductasa (ndhD, ndhF, ndhH), que codifican una enzima que protege a las células contra el estrés ambiental que puede ocurrir en presencia de AZ. Además, los procariotas pueden desintoxicar las especies reactivas de oxígeno a través de un aumento de la biosíntesis de carotenoides (+ 1326%) y del metabolismo del glutatión (+ 344%) y mejorar la reparación celular (genes implicados en la reparación de desajustes, + 211%).

2. Síntesis y degradación de polisacáridos. La transcripción de varios genes relacionados con la biosíntesis de polisacáridos en eucariotas aumentó (archivo adicional 1: tabla S3), por ejemplo, los genes de las vías de biosíntesis de lipopolisacáridos (+353%). Un sistema asociado a los polisacáridos (transportador ABC, +162%) también se sobreexpresó tanto en el grupo AZ como en el de control, que se ha demostrado que exporta polisacáridos fuera de las células. Se ha informado de un aumento de la síntesis de polisacáridos en el fitoplancton en entornos estresantes. En cambio, en las bacterias, 4 vías (biosíntesis de N-glicanos, varios tipos de biosíntesis de N-glicanos, biosíntesis de lipopolisacáridos y biosíntesis de peptidoglicanos) relacionadas con la síntesis de glicanos se infraexpresaron (en torno al 63~77%) de forma significativa (p < 0,05), pero la vía «otra degradación de glicanos» se sobreexpresó en ~ 10 veces en los microcosmos tratados con AZ en comparación con el control. Asumiendo que la disminución generalizada predicha en la síntesis de polisacáridos en procariota ocurrió en las cianobacterias, una disminución putativa en el lastre de polisacáridos en las cianobacterias podría ayudar a mantener las cianobacterias en la superficie del lago y ayudar a explotar la luz, que se atenúa fuertemente con la profundidad durante la floración. Varias cianobacterias, incluyendo las del género Synecocchococus, han demostrado efectivamente que modulan la flotabilidad a través de la síntesis de polisacáridos.

3. Modulación de la biosíntesis de vitaminas e interacciones potenciales entre bacterias y eucariotas. En los eucariotas, todas las vías relacionadas con la biosíntesis de la vitamina B (por ejemplo, tiamina, riboflavina, niacinamida, pantotenato, vitamina B6, biotina, ácido lipoico y folato) se sobreexpresaron (en un 14~243%) en los microcosmos tratados con AZ en comparación con el control (archivo adicional 1: tabla S4). Por el contrario, en las bacterias, las vías bioquímicas relacionadas con la biosíntesis del folato, la nicotinamida y la tiamina se sobreexpresaron (37~139%) tras la exposición al AZ en los microcosmos, mientras que las vías biosintéticas de vitaminas en menor abundancia relativa (es decir, biotina y ácido lipoico, riboflavina, B6) se infraexpresaron significativamente (en un 22~68%, p < 0,05) en los microcosmos tratados con AZ en comparación con el control (Archivo adicional 1: Tabla S4). Curiosamente, en las bacterias, la abundancia relativa de dos genes implicados en el transporte de vitamina B12 (cobalamina) (es decir, btuB o K16092: transportador de vitamina B12 y btuF o K06858: proteína de unión a sustrato del sistema de transporte de vitamina B12) disminuyó en un 88% y 57%, respectivamente, en los microcosmos tratados con AZ en relación con el control (véase el archivo adicional 2: conjunto de datos 5). Dado que varias especies eucariotas (incluidos los hongos y muchas clorofitas) no pueden sintetizar cobalamina de novo y dependen de las bacterias mutualistas para adquirir esta vitamina , nuestros resultados apoyan la hipótesis de que el aumento de las cianobacterias en presencia de AZ puede explicarse, al menos en parte, por una disminución del intercambio mutualista de vitamina B12 entre bacterias y eucariotas.

AZ cambió las interacciones entre hongos, algas eucariotas y cianobacterias

Nuestros resultados son consistentes con las interacciones alelopáticas entre hongos o eucariotas y procariotas con potenciales implicaciones en la dinámica del florecimiento de cianobacterias. En primer lugar, la disminución de la actividad relativa de muchos hongos, que produce varios metabolitos secundarios que promueven la lisis celular de las cianobacterias, puede favorecer a las cianobacterias. En segundo lugar, dos vías eucariotas de biosíntesis de antibióticos (biosíntesis de monobactamas (+ 1524%) y biosíntesis de penicilinas y cefalosporinas (+ 161%), se expresaron preferentemente entre 1,6 y 15 veces bajo la exposición a AZ. Esto sugiere que los microorganismos eucariotas podrían responder al aumento de las cianobacterias mediante la producción de compuestos antibacterianos, aunque es poco probable que esto evite los brotes de floración de cianobacterias. En tercer lugar, como se muestra en el archivo adicional 1: Figura S7, la abundancia relativa de cianobacterias en la comunidad bacteriana fue del 39,3% en nuestro sitio de muestreo del lago Taihu (derivado de los datos de secuenciación del gen 16S rRNA), mientras que la RAT de cianobacterias en las bacterias después de 7d-cultivo en los grupos de control y tratados con AZ fueron 7,1% y 72,1%, respectivamente. Esto indica que la gran proporción de algas verdes (Fig. 3c) podría limitar la actividad de las cianobacterias, incluso en condiciones eutróficas.

Impacto potencial a largo plazo de la contaminación por AZ a corto plazo

Como se muestra en el archivo adicional 1: Figura S8, después de 50 días de cultivo, las algas y la materia orgánica se asentaron en los microcosmos, dejándolos claros en el grupo de control. Sin embargo, el grupo AZ seguía mostrando las características típicas de una floración de algas, con un aspecto verde y turbio. Este interesante fenómeno ilustró que, aunque la concentración de AZ estaba por debajo de los límites de detección después de 15 días en los microcosmos (Fig. 1d), la alta variabilidad en la etapa primaria todavía causa una influencia duradera hasta los 50 días (archivo adicional 1: Figura S8). El residuo de AZ fue ampliamente detectado en el medio acuático, indicando que estos cuerpos de agua pueden haber sufrido alguna vez una contaminación de alta concentración de AZ a corto plazo. El AZ disuelto disminuyó rápidamente en los microcosmos (Fig. 1d), cayendo por debajo del límite de detección después de 15 días de cultivo de algas, lo que indica que el AZ disuelto se disipó rápidamente en los microcosmos. En los sistemas acuáticos naturales, el AZ puede ser absorbido por el plancton, adsorbido en superficies orgánicas y sedimentos, o ser disipado a través de la biodegradación y la fotólisis. Por lo tanto, se espera que el pico de concentración de AZ sea mucho más alto que las concentraciones disueltas detectadas en lagos, arroyos o aguas subterráneas de 0,01 a 29,70 μg L-1 , lo que sugiere que las concentraciones de fungicidas cercanas a las utilizadas en nuestros experimentos bien pueden ocurrir transitoriamente lo que causaría efectos negativos a largo plazo. Por ejemplo, los residuos del fungicida Thiram® pudieron detectarse en el rango de 0,27-2,52 mg L-1 del agua superficial alrededor de las parcelas aplicadas . Además, otros fungicidas que pueden interactuar con el AZ existen en los sistemas acuáticos (a menudo adsorbidos a los sedimentos) y pueden ser liberados de nuevo en las aguas superficiales a través de la removilización de los sedimentos . De ello se deduce que las altas concentraciones de AZ en el medio ambiente (al menos de forma esporádica) podrían inducir efectos tóxicos en los microorganismos acuáticos, mientras que, paradójicamente, favorecen el crecimiento de las cianobacterias.

La contaminación por fungicidas siempre coexiste con el sobreenriquecimiento de nutrientes en los cuerpos de agua cercanos a las regiones agrícolas, donde se producen con frecuencia floraciones de cianobacterias. Podemos suponer que la eutrofización y el contaminante AZ se producirían simultáneamente en una zona de agua limitada cerca de las tierras de cultivo después de las lluvias, lo que provocaría cambios drásticos en la estructura de la comunidad microbiana y promovería las floraciones de cianobacterias. Estas cianobacterias podrían trasladarse a otras masas de agua tras las siguientes lluvias. Entonces cambiarán la estructura de la comunidad de las aguas contaminadas y contribuirán a la eutrofización de las aguas cercanas. Se sabe que la red ecológica microbiana tiene su propio equilibrio, que podría verse alterado por la eutrofización. Este estudio indica que los fungicidas pueden desempeñar un papel importante en la promoción de los HCB a través de complejas interacciones de la red comunitaria.