Sanes y Lichtman utilizaron la inyección pronuclear para insertar estas construcciones Brainbow en ratones. Cuando obtuvieron imágenes de los cerebros de los ratones, encontraron muchos más de 3-4 colores debido a la integración en tándem de múltiples copias del constructo (unas 8 en los ratones Brainbow-1.0.) El efecto combinatorio de múltiples eventos de recombinación independientes da lugar a un arco iris de colores. Con tres copias de la construcción, cabría esperar diez colores (véase la tabla de la derecha); en varios informes, Sanes y Lichtman han observado entre 90 y 160 colores distintos debido a un mayor número de copias. El nombre Brainbow es realmente apropiado para esta colorida tecnología.
Optimización del sistema: Brainbow-3
Aunque Brainbow proporcionó a los neurocientíficos la amplia gama de colores necesaria para marcar las neuronas individuales, el sistema también sufrió una serie de limitaciones. En primer lugar, la obtención de imágenes del tejido de ratones Brainbow era un reto debido a la baja intensidad de la fluorescencia, causada en parte por la fotoestabilidad de los fluoróforos, así como por la tendencia de los fluoróforos a agregarse en los somatos de las neuronas. En segundo lugar, el sistema no permitía el análisis mediante inmunotinción. Aunque los fluoróforos utilizados son fluorescentemente distintos, sus secuencias proteicas son altamente homólogas, lo que impide el diseño de anticuerpos específicos para cada fluoróforo. En tercer lugar, Brainbow-1 y Brainbow-2 contenían cada uno un estado «por defecto»; por ejemplo, Brainbow-1.0 expresa RFP cuando la construcción no ha sufrido recombinación. Este estado por defecto se expresaba de forma desproporcionada en la mayoría de las neuronas, lo que limitaba el número de colores distintos que podían observarse en una zona determinada.
En 2013, Dawen Cai, et al. lanzaron un perfeccionamiento de la tecnología Brainbow, Brainbow-3.0, con el objetivo de superar las limitaciones mencionadas anteriormente. En primer lugar, examinaron una serie de proteínas fluorescentes para encontrar aquellas con características ideales (baja agregación, alta fotoestabilidad y alta estabilidad tras la fijación). De las siete proteínas resultantes, eligieron tres con bajos niveles de fluorescencia y solapamiento de secuencias (coral mOrange2, medusa EGFP y anémona marina mKate2). Para conseguir un etiquetado celular uniforme, generaron derivados farnesilados de las proteínas fluorescentes, que se dirigen directamente a las membranas celulares. El tráfico de membranas de los derivados farnesilados permite etiquetar los delicados procesos axonales y dendríticos que antes no eran visibles con Brainbow-1 y -2.
La estructura general de Brainbow-1.0 se mantiene en Brainbow-3.0, pero con mOrange2, EGFP y mKate2 como fluoróforos; mOrange2 es el estado por defecto. En cambio, Brainbow-3.1 y -3.2 no muestran la fluorescencia por defecto debido a la adición de un casete STOP que bloquea la traducción inmediatamente después del promotor. El casete STOP incluye una YFP mutante que no es fluorescente, pero que puede detectarse mediante inmunotinción. Esta característica facilita el cribado de los ratones Brainbow negativos a Cre para determinar el número y el tipo de células en las que se expresa la construcción. La fotoestabilidad de Brainbow-3.2 se ha mejorado gracias a la adición de un elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE), utilizado habitualmente para aumentar los niveles de proteína del transgén.
Variantes de Brainbow y aplicaciones más allá del cerebro de ratón
Además de mejorar el sistema Brainbow, Sanes y Lichtman también desarrollaron un constructo complementario Flpbow que es funcionalmente similar al Brainbow basado en Cre, pero está controlado por la recombinasa FLP/FRT. Cuando se colocan bajo promotores diferentes, Brainbow y Flpbow pueden utilizarse para etiquetar poblaciones celulares distintas.
Para disminuir la cría de animales necesaria para producir animales con transgenes Brainbow y Cre, Cai et al. también crearon una construcción Autobow que contiene tanto Cre como XFPs. La producción de Cre impulsa la recombinación y la selección de XFP, seguida de la autoexcisión de Cre. Estas construcciones se mantienen de forma estable durante al menos seis generaciones.
Además de las construcciones neuronales pThy1-Brainbow, Addgene también dispone de dos vectores virales adeno-asociados (AAV) Brainbow – AAV-EF1a-BbChT y AAV-EF1a-BbTagBY. Estas construcciones contienen dos XFP cada una debido a las limitaciones de tamaño asociadas al AAV; la coinfección con ambas construcciones produce un mínimo de 8 colores. El uso de AAV proporciona un control espacial y temporal sin necesidad de modificar la línea germinal, y permite utilizar Brainbow en una variedad de especies.
Otras variantes han sido creadas por otros laboratorios, incluyendo la R26R-Confetti descrita en Hugo J. Snippert, et al. (2010) y la estrategia MAGIC Marker descrita en Karine Loulier, et al. (2014).
Actualmente, las técnicas Brainbow también se están aplicando para estudiar organismos modelo como Drosophila y el pez cebra. En Drosophila, Brainbow ha ayudado a cartografiar los circuitos neuronales, como las conexiones entre las neuronas motoras y la unión neuromuscular. En el pez cebra, el método ha resultado muy útil en el rastreo de linajes; «Zebrabow» se utilizó para rastrear el desarrollo del epitelio de la córnea.
Para los científicos interesados en la neurociencia y el desarrollo, Brainbow es una valiosa herramienta para marcar y seguir células individuales debido a la amplia gama y la gran estabilidad de los colores. Sanes y Lichtman estiman que el etiquetado con colores de Brainbow ha reducido el tiempo de mapeo de una sección determinada del cerebro en al menos un orden de magnitud. Está claro que el perfeccionamiento de la técnica Brainbow proporcionará importantes conocimientos sobre la complicada organización física del cerebro y otros sistemas biológicos.
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Estrategias transgénicas para la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes en el sistema nervioso. Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Bennis RA, Sanes JR, Lichtman JW. Nature. 2007 Nov 1;450(7166):56-62. PubMed.
Una aproximación tecnificada al conectoma. Lichtman JW, Livet J, Sanes JR. Nature Reviews Neuroscience. 2008 Jun;9(6):417-22. doi: 10.1038/nrn2391. Epub 2008 Apr 30. PubMed.
La homeostasis de la cripta intestinal es el resultado de la competencia neutral entre las células madre Lgr5 que se dividen simétricamente. Snippert HJ, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H. Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. PubMed.
Drosophila Brainbow: una técnica de etiquetado de fluorescencia basada en la recombinasa para subdividir los patrones de expresión neuronal. Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):253-9. doi: 10.1038/nmeth.1566. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Flybow: genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Hadjieconomou D, Rotkopf S, Alexandre C, Bell DM, Dickson BJ, Salecker I. Nature Methods. 2011 Mar;8(3):260-6. doi: 10.1038/nmeth.1567. Epub 2011 Feb 6. PubMed.
Herramientas mejoradas para la caja de herramientas de Brainbow. Cai D, Cohen KB, Luo T, Lichtman JW, Sanes JR. Nature Methods. 2013 May 5:10(6):540-7. doi: 10.1038/nmeth.2450. Epub 2013 May 5. PubMed.
Zebrabow: etiquetado celular multiespectral para el rastreo celular y el análisis de linaje en el pez cebra. Pan YA, Freundlich T, Weissman TA, Schoppik D, Wang XC, Zimmerman S, Ciruna B, Sanes JR, Luchtman JW, Schier AF. Development. 2013 Jul;140(13):2835-46. doi: 10.1242/dev.094631. PubMed.
Rastreo múltiple de células y linajes con etiquetas combinatorias. Loulier K, Barry R, Mahou P, Le Franc Y, Supatto W, Matho KS, Ieng S, Fouquet S, Dupin E, Benosman R, Chédotal A, Beaurepaire E, Morin X, Livet J. Neuron. 2014 Feb 5;81(3):505-20. PubMed.
