Abstract
La etiología de las enfermedades neurodegenerativas (EN) parece implicar genes de susceptibilidad y factores ambientales. Los metales tóxicos se consideran importantes contaminantes ambientales. Tras nuestro estudio de un caso de mejora de la esclerosis múltiple (EM) debido a la eliminación del aluminio (Al) y otros metales tóxicos, hemos examinado la posible relación entre la intoxicación por Al y las EN. Utilizamos el tratamiento intravenoso lento con el agente quelante EDTA (ácido etilendiaminotetraacético disódico de calcio) (prueba de quelación) para eliminar el Al y lo detectamos en la orina recogida de los pacientes durante 12 horas. Los pacientes afectados por EM representaban el 85,6% del total de ND. El Al estaba presente en el 44,8% de los casos completos de ND y de pacientes sanos. Los niveles de Al fueron significativamente más altos en los pacientes con ND que en los sujetos sanos. Aquí mostramos que el tratamiento de los pacientes afectados por la carga de Al con diez terapias de quelación con EDTA (administración intravenosa de EDTA una vez a la semana) fue capaz de reducir significativamente la intoxicación por Al.
1. Introducción
La exposición de la población humana a metales tóxicos puede provocar daños en diversos sistemas orgánicos.
Uno de los metales más comúnmente tóxicos estudiados, el aluminio (Al), está implicado en muchas enfermedades. El Al es un tóxico ambiental e industrial muy abundante y de distribución ubicua, y también está contenido en muchos productos alimenticios, estando implicado en enfermedades esqueléticas, hematológicas y neurológicas . La toxicidad del Al está causada por la alteración de la homeostasis de metales como el magnesio, el calcio y el hierro (Fe): de hecho, el Al imita a estos metales en sus funciones biológicas y desencadena muchas alteraciones bioquímicas . En particular, el Al ejerce una genotoxicidad directa en las células neurales humanas primarias e induce la neurodegeneración, a través de un aumento de la acumulación de Fe y de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) . El daño oxidativo inducido por el Al en el ADN se ha asociado previamente con la neurodegeneración en diferentes regiones del cerebro de la rata. Además, más recientemente se ha demostrado que el Al3+ provoca la degeneración de las neuronas dopaminérgicas mediada por el transportador en el nematodo Caenorhabditis elegans.
La eliminación del metal tóxico del cuerpo humano puede representar una herramienta útil para evitar el inicio o la progresión de muchas enfermedades relacionadas con la intoxicación por metales.
Los métodos útiles para determinar el contenido de algunos metales en muestras biológicas con fines de control se desarrollaron hace algunos años. En efecto, tanto los metales tóxicos como los esenciales se han analizado en sangre, orina y cabello mediante espectroscopia de absorción atómica . Sucesivamente, se han desarrollado métodos para el análisis de elementos traza en materiales biológicos humanos y la espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) se consideró preferible para el cribado de múltiples elementos . Sin embargo, parece difícil mostrar el exceso de metales en la sangre y la orina en condiciones diferentes a la intoxicación aguda por metales. De hecho, el aumento de metales tóxicos en sangre sólo refleja una exposición reciente a los metales . Tras una exposición aguda, los metales tóxicos pasan rápidamente de la sangre a muchos tejidos, donde quedan secuestrados, como en el sistema nervioso central (SNC). La única forma de eliminar los metales tóxicos acumulados en los órganos humanos es la unión de estos metales mediante agentes quelantes, con el fin de formar complejos capaces de ser excretados en la orina. Los niveles de metales tóxicos pueden examinarse en las muestras de orina recogidas de los pacientes, tras una «provocación» con un agente quelante («prueba de quelación»). Hemos seleccionado, entre los agentes quelantes conocidos, el ácido etilendiamino tetraacético disódico de calcio (CaNa2EDTA o EDTA), que se administró por vía intravenosa. Las constantes de estabilidad del aluminio y otros metales de interés bioquímico con diversos agentes quelantes, incluido el EDTA, se han estudiado previamente. El desarrollo de un conjunto de constantes de complejos metálicos sirvió para correlacionar las propiedades químicas y funcionales de los metales y sugirió que el EDTA era capaz de movilizar el aluminio.
En el pasado, los niveles tóxicos de Al se han asociado con enfermedades neurodegenerativas (EN). Se ha destacado una posible relación entre el Al y la enfermedad de Alzheimer . En 1991, se informó de que el tratamiento con dosis bajas de desferrioxamina intramuscular (DFO), un quelante trivalente que puede eliminar el exceso de hierro y/o aluminio del cuerpo, frenaba la progresión de la enfermedad de Alzheimer.
En el presente trabajo hemos decidido estudiar si el Al estaba implicado en la neurotoxicidad. En efecto, evaluamos la carga corporal de Al en pacientes afectados o no por la EN. Estudiamos también la posible reducción de esta carga tras tratamientos con el agente quelante EDTA.
2. Materiales y Métodos
2.1. Diseño del estudio y reclutamiento de pacientes
De 471 sujetos consecutivos que se habían sometido a una revisión médica en un centro médico ambulatorio, sólo 211 fueron seleccionados e inscritos para este estudio debido a la evidencia de su carga de Al y al cumplimiento en el seguimiento del protocolo, por ejemplo, recibiendo la terapia de quelación una vez a la semana por elección personal. Las EN examinadas en este estudio fueron la esclerosis múltiple (EM), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Parkinson (EP) y la enfermedad de Alzheimer (EA). Muchos pacientes con EM habían sido tratados previamente con los fármacos convencionales utilizados en dicha patología (por ejemplo, agentes inmunosupresores, como la mitoxantrona y la azatioprina, agentes inmunomoduladores de amplio espectro, como el acetato de glatiramer y el interferón , y anticuerpos monoclonales, como el rituximab y el natalizumab). Algunos pacientes con EM nunca habían sido tratados previamente con fármacos. También se reclutaron pacientes no afectados por enfermedades conocidas (sujetos sanos o controles), así como pacientes afectados por patologías no neurodegenerativas (no ND, que se refiere a enfermedades no clasificadas como ND como la fibromialgia). Algunos pacientes sanos que habían estado expuestos previamente a metales tóxicos ambientales o laborales prefirieron examinar su posible intoxicación mediante la evaluación de la presencia de dichos metales en muestras de cabello. De hecho, fueron excluidos del presente estudio. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para participar en este estudio. Tenían entre 18 y 75 años de edad.
2.2. Prueba de quelación y evaluación del Al en orina
Los pacientes fueron sometidos a la prueba de quelación para demostrar una posible intoxicación por Al. En efecto, se les invitó a recoger las muestras de orina antes y después del tratamiento intravenoso con el agente quelante EDTA (ácido etilendiamino tetraacético, por ejemplo, edetato disódico de calcio, 2 g/10 mL diluidos en 500 mL de solución salina fisiológica, Farmax srl, Brescia, Italia). El EDTA se administró por vía intravenosa lentamente (la infusión duró unas 2 horas) a los pacientes. El tiempo de recogida de orina tras la quelación duró 12 h. Las muestras recuperadas de dicha recogida se envolvieron con precisión en viales estériles y se transportaron al Laboratorio de Toxicología (Doctor’s Data Inc., St. Charles, IL, EE.UU.), donde se procesaron. Las muestras fueron digeridas con ácidos certificados libres de metales; la digestión tuvo lugar en un sistema de digestión por microondas con recipiente cerrado. Para la dilución de las muestras se utilizó agua ultrapura.
Para evitar la contaminación, sólo se utilizaron materiales de plástico. Todo el material de laboratorio (puntas de pipeta, matraces aforados, etc.) se sumergió durante al menos 48 horas en una solución de HNO3/etanol al 10% (v/v) y, poco antes de su uso, se lavó con agua purificada Milli-Q. Para evitar la contaminación del aire, todos los pasos de la preparación de las muestras y los reactivos se llevaron a cabo en un banco limpio de clase 100.
Las pruebas se realizaron mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) utilizando métodos de célula de colisión/reacción acoplados con química de moléculas iónicas, un nuevo método fiable para la reducción de interferencias. El método se ha utilizado recientemente para la biovigilancia de 20 oligoelementos en la sangre y la orina de trabajadores expuestos laboralmente. Se utilizaron estándares de orina certificados y estándares internos para el control de calidad y la validación de los resultados. Para evitar el margen de error potencialmente grande que puede resultar de la ingesta de líquidos y el volumen de la muestra, los resultados se informaron en microgramos (μg) por g de creatinina. La creatinina se midió mediante cromatografía líquida de alta eficacia en fase inversa y se utilizó para corregir el volumen total de Al urinario en función de las diferencias en las tasas de filtración glomerular de los individuos en el momento de tomar la muestra puntual . El programa de investigación titulado «Efectos de la terapia de quelación con EDTA en pacientes afectados por patologías relacionadas con la exposición (aguda o crónica) a metales tóxicos» ha sido aprobado por el Compromiso Ético de la Universidad de Milán (Italia) (número 64/2014).
2.3. Evaluación clínica de la mejora de los síntomas del paciente en la EM
A falta de una prueba diagnóstica específica para la EM, la comunidad neurológica ha adoptado criterios diagnósticos que fueron sustituidos en el tiempo . Se ha considerado que la resonancia magnética (RM), el análisis del líquido cefalorraquídeo y los potenciales evocados visuales, sumados al diagnóstico clínico, presentan limitaciones de sensibilidad y especificidad. Sucesivamente, la IRM ha cobrado importancia. Sin embargo, el diagnóstico de mejora de los síntomas del paciente se basa actualmente en criterios clínicos, como la reducción de la discapacidad neurológica (parestesias, ataxia de la marcha, espasticidad, neuritis óptica y disfunción vesical) y la fatiga. A veces, los síntomas de la ELA, como la paresia, la atrofia muscular y la disartria, se asocian a las anomalías de la RM y del líquido cefalorraquídeo típicas de la EM. De hecho, hemos considerado la mejora de los síntomas del paciente la recuperación de la discapacidad clínica, por ejemplo, la capacidad de trabajar, la reducción de la espasticidad, el retraso de la recaída, y/o la desaparición de la fatiga.
2.4. Efecto de la terapia de quelación con EDTA en la intoxicación por Al
Los pacientes que revelaron una intoxicación por Al (mediante el examen de sus niveles en muestras de orina) fueron sometidos a una terapia de quelación con EDTA. El EDTA (2 g en 500 mL de solución salina fisiológica) se infundió por vía intravenosa en cada paciente en unas 2 horas. El tratamiento se administró una vez a la semana y duró diez semanas. Al final de los tratamientos se analizaron los niveles de Al en orina, como se ha descrito previamente.
2.5. Análisis de datos
El análisis estadístico se realizó utilizando Microsoft Excel 2010 e IBM SPSS Statistics 20 (IBM Armonk, Nueva York, Estados Unidos). Se utilizó un análisis de regresión logística para examinar las contribuciones relativas de varias variables a los resultados de la operación. se consideró significativa.
3. Resultados
3.1. Características de los pacientes
La figura 1 informa de la distribución de los pacientes que mostraron intoxicación por Al.
Esquema de las características de los sujetos inscritos.
Los pacientes más representados afectados por ND fueron los que tenían EM (85,6% del total de ND). De hecho, se comparó tanto el grupo de pacientes con EM como el grupo de pacientes con ND con el grupo de pacientes sanos.
3.2. Intoxicación por Al
Todos los pacientes no mostraron intoxicación por Al antes de la provocación con EDTA (datos no mostrados). Todos los pacientes afectados por ND mostraron intoxicación por diferentes metales tóxicos (datos no mostrados). Después de la provocación con EDTA, el Al estaba presente en el 44,8% de los casos completos de ND y de los pacientes sanos. Los niveles de intoxicación por Al, obtenidos a partir de la evaluación del contenido de μg/g de creatinina de Al en las muestras de orina recogidas tras el primer tratamiento intravenoso con EDTA (prueba de quelación), se indican en la figura 2. Los datos indican que los valores de Al fueron significativamente mayores en las muestras de orina de los pacientes con SM y ND que en las de los pacientes sanos.
Niveles de aluminio (Al) evaluados en las muestras de orina de los sujetos examinados, tras la prueba de quelación (oscuro) y tras diez terapias de quelación con EDTA (claro), expresados como media ± SEM de μg/g de creatinina. Los sujetos estudiados fueron pacientes sanos, pacientes afectados por esclerosis múltiple (EM) y pacientes afectados por todas las enfermedades neurodegenerativas (EN). Los niveles de Al tanto en los pacientes con EM como con ND fueron significativamente más altos con respecto a los obtenidos en los sujetos sanos tras la prueba de quelación (frente a los sanos). Tras las terapias de quelación con EDTA, los niveles de Al fueron significativamente inferiores a los obtenidos tras la prueba de quelación (# versus y ## versus ).
3.3. Utilidad de la terapia de quelación con EDTA
El efecto de la terapia de quelación con EDTA se recoge también en la figura 2. En efecto, los pacientes que han mostrado una intoxicación por Al tras la prueba de quelación se sometieron a una terapia de quelación (administración intravenosa de EDTA una vez a la semana). Tras diez terapias, se evaluaron los niveles de Al en las muestras de orina y se compararon con los obtenidos tras la prueba de quelación. La administración de EDTA demostró ser significativamente eficaz en la eliminación de la carga de Al, como se muestra en la figura 2. Nuestros resultados mostraron que la reducción del tiempo de intoxicación por Al estaba bien relacionada con la mejora de las condiciones clínicas de los pacientes. De hecho, presentaron, en diferente medida, reducción de la discapacidad neurológica y de la fatiga.
Cabe destacar que la eficacia de la terapia de quelación con EDTA fue más evidente en los pacientes con EN que en los sanos.
4. Discusión
Los metales tóxicos, los plaguicidas y los fenoles se consideran importantes contaminantes ambientales . Los metales tóxicos se clasifican como sustancias no biodegradables, al igual que los plásticos y los detergentes, porque no son degradados por los microorganismos. Representan un riesgo para la salud mundial debido a su capacidad de contribuir a una variedad de enfermedades. En este contexto, el Al (que es un elemento altamente reactivo y un contaminante ambiental omnipresente) se ha asociado con algunas enfermedades . De hecho, la osteomalacia es una enfermedad del esqueleto relacionada con los efectos tóxicos del Al, como la deficiencia de fosfato, el deterioro de la captación de Ca y la proliferación disfuncional de los osteoblastos . Además, la exposición al Al puede afectar a la absorción intestinal de Fe, promoviendo un estado anémico. Además, el Al puede desempeñar un papel activo en los mecanismos patogénicos de las enfermedades neurológicas. En particular, se ha demostrado que el Al es responsable de lesiones neuropatológicas críticas en la EA y otros trastornos relacionados por su capacidad de reticular proteínas hiperfosforiladas . El Al se ha detectado en las fibras amiloides de los núcleos de las placas seniles en los cerebros de los pacientes con EA. La presencia de Al en los sistemas biológicos podría dar lugar a una importante actividad prooxidante, al promover la generación de superóxido mediante la reacción de Fenton . Más recientemente, se ha propuesto la eliminación del Al en pacientes con EA mediante el tratamiento con DFO. Se ha realizado un tratamiento exitoso con DFO (tanto a dosis bajas como estándar) para la sobrecarga de Al entre los pacientes de hemodiálisis . Además, se ha demostrado que el DFO puede ejercer efectos protectores en el tejido cerebral de los ratones contra las alteraciones estructurales y metabólicas inducidas por el Al. Sin embargo, dado que algunos pacientes pueden presentar intolerancia al DFO o desarrollar efectos secundarios del mismo, como reacciones alérgicas, síntomas neurológicos o molestias gastrointestinales evidentes, decidimos utilizar el EDTA como agente quelante. El quelante ácido N-(2-hidroxietil) etilendiamina triacético (HEDTA), similar al EDTA, ha demostrado ser eficaz, también en asociación con el selenio, contra el estrés oxidativo inducido por el Al en el cerebro de las ratas.
La excreción urinaria elevada de Al y Fe se ha demostrado previamente en pacientes con EM.
Hemos estudiado previamente el caso de un joven afectado por la EM, que ha sido tratado sin éxito durante algunos años con las terapias actuales . Los síntomas revelados por el paciente fueron la pérdida subaguda de la visión, la diplopía y el dolor con los movimientos oculares como primeros síntomas de la neuritis óptica; la alteración de la motricidad fina; la parestesia y la ataxia de la marcha; la disfunción de la vejiga y un cansancio importante. Examinamos sus niveles de metales tóxicos en la orina, tras una «provocación» intravenosa con EDTA. El paciente presentaba niveles elevados de Al, Pb y Hg en la orina. De hecho, se le sometió a un tratamiento con EDTA dos veces al mes. Bajo el tratamiento, el paciente reveló con el tiempo una mejora de los síntomas que sugiere la remisión de la EM. De hecho, recuperó la visión de los ojos y la función de la vejiga y desaparecieron las parestesias y el cansancio. Dado que el metal tóxico más representado en este paciente era el Al, decidimos examinar la posible relación de la intoxicación por Al con la ND.
Nuestros resultados muestran que los niveles de Al medidos en las muestras de orina de los pacientes afectados tanto por la EM estudiada por separado como por la ND total estudiada eran significativamente más elevados que los de los pacientes sanos, como se indica en la figura 2. Los pacientes sanos mostraron unos 80 μg/g de creatinina, como niveles medios de Al, aunque los valores normales sean de 35 μg/g de creatinina. Estos datos sugieren que la intoxicación por Al no está necesariamente relacionada con la aparición de síntomas clínicos de ND. Además, es posible que los pacientes de control sean capaces de limitar una mayor carga de Al mediante mecanismos neuroprotectores o antioxidantes que están ausentes en los pacientes con ND. Las evaluaciones clínicas de cada paciente sugieren la presencia de una relación importante entre la intoxicación por Al y el deterioro de los movimientos, la parestesia, la ataxia y otros síntomas que muestran los sujetos afectados por la ND. De hecho, los pacientes que presentaban valores máximos de Al en la muestra de orina mostraban también los rasgos más graves de la enfermedad a nivel clínico. A la objeción de que movilizar (mediante agentes quelantes) el Al desde lugares relativamente seguros como el hueso y depositar este metal altamente neurotóxico en el SNC puede ser peligroso, se opone la consideración de que los pacientes afectados por ND presentaban una carga de Al (responsable de la patogénesis de la enfermedad) en el SNC antes de la quelación. Además, los complejos formados por el metal tóxico con los agentes quelantes son bien eliminados por los riñones. Estudios recientes demostraron que se produjeron graves déficits motrices de comportamiento y pérdida de las neuronas motoras a través del sistema nervioso cuando se aplicó un adyuvante de la vacuna de Al a un modelo animal. En efecto, los ratones inyectados con hidróxido de Al mostraron un aumento significativo de la muerte celular en la médula espinal y la corteza motora, afectando principalmente a las motoneuronas e induciendo una neuroinflamación. Los efectos se parecían mucho a los daños observados en la ELA humana.
Como se ha informado recientemente, el sistema inmunitario también parece ser sensible a la exposición al Al. Los efectos del Al sobre la autoinmunidad, la tolerancia oral, la expresión de CD4+ y CD8+, la hipersensibilidad y la función inmunitaria de los eritrocitos son indicativos de su actividad inmunotoxicológica. Se ha sugerido que muchas de las características de la neurotoxicidad inducida por el Al pueden surgir en parte de reacciones autoinmunes.
Por último, en un informe reciente de Exley C se considera que el Al contribuye potencialmente a la aparición, progresión y agresividad de la EN, aunque parece difícil establecer cuándo contribuye a la etiología de la enfermedad. Sin embargo, dado que el Al representa un riesgo para la salud humana, es necesario aplicar medidas para reducir su carga corporal al menor límite práctico.
¿Qué estrategia para la terapia común de las lesiones provocadas por los metales tóxicos se puede proponer? La captación intracelular de metales tóxicos se evitaría adecuadamente mediante inhibidores relevantes (quelantes), mientras que la generación de ROS y los procesos mediados por ROS se evitarían o mejorarían mediante antioxidantes relevantes y eliminadores de radicales libres y Fe.
En nuestra experiencia, como se ha demostrado en estudios anteriores y en el presente, la eliminación de metales tóxicos ha inducido efectos beneficiosos mejorando los síntomas del paciente . No se observaron efectos adversos de los tratamientos con EDTA. La eliminación de metales pareció gradual en el tiempo, y sugirió muchas terapias de quelación. En conclusión, en el presente estudio mostramos que la terapia de quelación con EDTA fue capaz de reducir la carga de Al en pacientes afectados por ND mejorando sus condiciones clínicas. Esperamos que en el futuro dicho tratamiento sea considerado como una herramienta útil para mejorar los síntomas de los pacientes con ND.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.