Enfoques no orgánicos
Hasta la fecha, las líneas celulares epiteliales intestinales han sido los principales sistemas modelo in vitro para evaluar los procesos de transporte intestinal, mientras que las líneas celulares enteroendocrinas son modelos comunes para estudiar la secreción de diferentes hormonas intestinales. Un modelo establecido para los enterocitos del intestino delgado es la línea celular CaCo-2 (o el subclon CaCo-2 TC7), derivada de un adenocarcinoma de colon. Esta línea celular se cultiva habitualmente en placas transwell hasta 3 o 4 semanas postconfluencia para estudios sobre el transporte intestinal de nutrientes, fármacos u otros compuestos utilizando sustratos marcados con radio o fluorescencia (Farrell et al., 2013; Ganapathy et al., 1995; Wang y Li, 2017). Las células HT-29 (y subclones) son una línea celular de carcinoma de colon humano bien establecida para la investigación de los transportadores intestinales, en particular los transportadores de azúcar (Delezay et al., 1995; Liu et al., 2016). Sin embargo, para estudiar el papel de los transportadores en la detección de nutrientes en el intestino, se necesitan otras líneas celulares. Las líneas celulares enteroendocrinas más destacadas que se utilizan para estudiar la secreción hormonal intestinal son la línea celular murina GLUTag (Emery et al., 2015), la línea celular murina STC-1 (Jiang et al., 2016) y la línea celular humana NCI-H716 (Pais et al., 2014). Sin embargo, ninguna de ellas refleja la compleja biología de las células enteroendocrinas in vivo (Kuhre et al., 2016). Las células enteroendocrinas están distribuidas por todo el intestino delgado y grueso, y sus patrones de expresión de las diferentes hormonas intestinales difieren mucho, dependiendo de su ubicación dentro del tracto intestinal (Habib et al., 2012). Por ejemplo, el número de células secretoras de GLP-1 (a menudo denominadas células L) aumenta gradualmente desde el intestino proximal al distal, mientras que las células secretoras de GIP (denominadas células K) disminuyen. Por lo tanto, las líneas celulares enteroendocrinas, que son todas derivadas de tumores, representan sistemas modelo muy simples y artificiales para la investigación de la detección de nutrientes, la secreción de hormonas intestinales y los mecanismos moleculares y reguladores subyacentes. La ventaja de las líneas celulares de mamíferos es que están bien establecidas por numerosos laboratorios de todo el mundo. Hay muchos datos científicos disponibles, así como protocolos experimentales establecidos. Además, son fáciles de manejar y su cultivo es barato. Sin embargo, todas estas líneas celulares son sistemas modelo muy simples y artificiales. En su mayoría son derivadas de tumores y representan un solo tipo celular, lo que no refleja la complejidad de la mucosa intestinal, que comprende múltiples tipos celulares especializados. Además, normalmente se cultivan en dos dimensiones, lo que no refleja la arquitectura tridimensional del intestino nativo.
En particular, para los estudios sobre la detección de nutrientes y la secreción de hormonas intestinales, el cultivo de células intestinales primarias es un enfoque mucho mejor, y se ha establecido como un modelo fiable en los últimos años (Reimann et al., 2008). Los cultivos primarios realizados a partir de criptas intestinales aisladas tienen la ventaja de que pueden generarse a partir de diferentes segmentos intestinales (Parker et al., 2012), y de ratones (animales de tipo salvaje o knockout) (Diakogiannaki et al., 2013), o humanos (Habib et al., 2013). Comprenden enterocitos absorbentes, así como diferentes subtipos de células enteroendocrinas, tal y como se encuentran en el intestino nativo. Sin embargo, estos cultivos contienen enterocitos poco diferenciados, por lo que no son adecuados para la detección de transportadores y receptores intestinales a nivel proteico o funcional. Son un sistema de cultivo a corto plazo no apto para experimentos a largo plazo, y no pueden ser pasados, lo que aumenta el número de animales de laboratorio necesarios para la preparación del cultivo. Lo mismo ocurre con las células epiteliales intestinales aisladas (Grossmann et al., 1998), que comprenden todos los tipos de células de la mucosa pero muestran una viabilidad muy limitada in vitro, y no representan un epitelio intacto.
La estabilidad a corto plazo es también una limitación de los explantes de tejido, como los anillos intestinales evertidos (Roder et al., 2014), o sacos intestinales de ratón o rata (Praslickova et al., 2012; Surampalli et al., 2016), que suelen utilizarse para estudios de transporte. Los anillos intestinales evertidos pueden incubarse con sustratos marcados in vitro, o pueden prepararse tras la administración oral de, por ejemplo, sustratos transportadores radiomarcados en roedores (Roder et al., 2014). Los sacos intestinales evertidos pueden incluso utilizarse para estudios de flujo, ya que los compartimentos luminal y basolateral pueden ser objeto de estudio por separado. Sin embargo, la preparación y la manipulación no son triviales y requieren cierta experiencia. La ventaja de los explantes de tejido es que pueden prepararse a partir de diferentes segmentos intestinales, y sus características in vivo específicas de la región se conservan in vitro. El explante intestinal conserva su arquitectura nativa, y la mucosa está conectada a su tejido circundante, como la submucosa o el músculo, y se incluyen neuronas, linfa y vasos sanguíneos. Dependiendo de la cuestión científica, esto puede ser una ventaja o una desventaja. La detección intestinal de nutrientes y la subsiguiente secreción de hormonas intestinales se investiga a veces en el intestino de roedores perfundido (Kuhre et al., 2015). Se anestesia al animal y se perfunde el lumen intestinal con los supuestos estimulantes ex vivo. Se recoge el líquido basolateral y se analiza el contenido hormonal del intestino. Esta técnica no es técnicamente fácil, y los obstáculos éticos limitan el amplio uso de este método para los estudios sobre la liberación de hormonas intestinales inducida por nutrientes.
Un modelo fiable y bien establecido utilizado para los estudios sobre las características funcionales y la regulación de los transportadores intestinales es la expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus laevis (Hirsch et al., 1996). Tras la inyección de ARNm, la proteína de interés se expresa en el ovocito, y la cinética de transporte puede investigarse utilizando sustratos radiomarcados o enfoques electrofisiológicos en el caso de los transportadores electrogénicos (Schulze et al., 2014; Stelzl et al., 2016). Esta técnica es una excelente herramienta para estudiar las características funcionales de un transportador en particular, aunque la proteína objetivo se encuentra en un entorno artificial y no hay factores reguladores presentes, como lo serían en la célula de mamífero. Además, la disponibilidad de ovocitos intactos y la complicada manipulación, incluida la inyección de ovocitos, son cuestiones críticas que hay que tener en cuenta al aplicar esta técnica. Los sistemas de expresión heteróloga más fáciles son la levadura y E. coli. Permiten la generación de mutantes recombinantes que, una vez generados, pueden cultivarse o fermentarse a mayor escala, proporcionando grandes cantidades de proteínas. Aunque son baratos y fáciles de manejar, estos microorganismos son sistemas modelo muy simplificados para la investigación de las proteínas de los mamíferos, y en particular de las grandes proteínas de membrana. Los problemas que suelen presentarse son el mal plegamiento de la proteína, o la inserción fallida en la membrana. Por lo tanto, estos sistemas son bastante más útiles para la caracterización estructural de proteínas purificadas o dominios proteicos (Beale et al., 2015) que para estudios detallados sobre la función y la regulación de los transportadores de mamíferos.
Unos enfoques novedosos y prometedores que se han establecido en un pasado muy reciente son los modelos tridimensionales de cultivos celulares de mamíferos. Las líneas celulares intestinales, como CaCo-2 o HT-29, se cultivan en andamios, creando una arquitectura más parecida a la del intestino que conduce a una mejor diferenciación (Chen et al., 2015). Otros modelos tridimensionales se cultivan directamente a partir de células epiteliales humanas del intestino delgado y miofibroblastos en membranas microporosas recubiertas (Maschmeyer et al., 2015a; Maschmeyer et al., 2015b), y no pueden multiplicarse in vitro. Estos modelos tienen el potencial de establecerse para estudios de transporte de nutrientes o fármacos, y los cultivos cultivados a partir de células epiteliales intestinales humanas comprenden incluso diferentes tipos de células de la mucosa, pero no células enteroendocrinas. Lo mismo ocurre con los tejidos tridimensionales bioimpresos, otra tecnología que ha surgido muy recientemente y que ha ganado una enorme atención. Este enfoque tiene más valor para la medicina regenerativa y los trasplantes que para la investigación experimental (Murphy y Atala, 2014). Se ha establecido con éxito la bioimpresión de diferentes tejidos, incluidos el corazón, la piel y los huesos, pero los tejidos intestinales bioimpresos son poco frecuentes hasta la fecha y deben seguir mejorándose (Wengerter et al., 2016).