De los fragmentos de ADN que inicialmente intentamos amplificar sólo tlp2, che1P, y cheA1 (Tabla 1) produjeron un producto de amplificación por PCR sin el uso de aditivos de disolventes, cuando el ADN genómico de A. brasilense (Figura 1). Primero se probaron los efectos del DMSO al 1,25%, 2,5%, 5,0%, 7,5% y 10% (p/vol), así como de la formamida a concentraciones similares como aditivos en la PCR (Figura 1). También se ejecutó un conjunto de PCR con BSA a 1-10 μg/μl (datos no mostrados). En consonancia con los datos de la bibliografía, aunque tanto la adición de DMSO como de formamida en la PCR promovieron un mayor rendimiento de amplificación de fragmentos de ADN de 2-3 kb, el efecto potenciador del DMSO fue mayor que el de la formamida (Figura 1). En estas condiciones, también observamos que el aumento de la concentración de DMSO también podía conducir a la disminución de la especificidad de la PCR (Figura 2). Por otro lado, el efecto de la formamida en la promoción de un mayor rendimiento de la PCR disminuyó para los fragmentos de ADN mayores de unos 2,5 kb (Figura 1). En estas condiciones, la adición de BSA sola como aditivo de la PCR no tuvo ningún efecto significativo, ni siquiera perjudicial (datos no mostrados). Los efectos potenciadores de la BSA en los rendimientos de la PCR se detectaron cuando se utilizó en combinación con DMSO o formamida, en una amplia gama de tamaños de fragmentos de ADN (Figura 2). Además, la adición de BSA amplió el rango de concentraciones para las que se podía añadir el disolvente orgánico, incluso para plantillas de ADN de mayor tamaño (Figura 2). El consenso de la literatura actual sobre la formamida indica que es más eficaz como aditivo para la PCR cuando se utiliza en concentraciones que oscilan entre el 0 y el 5%, y que su eficacia disminuye por completo a partir del 10%. Nuestros resultados indican que, en presencia de BSA, la formamida es eficaz al menos hasta concentraciones del 10% y con plantillas de ADN de hasta 2,5 kb de tamaño (tlp2); sin embargo, no consiguió promover la amplificación de fragmentos de ADN de mayor tamaño (Figura 1). Este resultado es coherente con el efecto reportado de la formamida como más eficiente para las amplificaciones de plantillas de ADN de hasta aproximadamente 2,5 kb y apoya aún más la noción de que el DMSO y la formamida mejoraron los rendimientos de la PCR por diferentes mecanismos. Independientemente de estas diferencias, la adición de BSA a esta PCR pareció promover y ampliar aún más los efectos beneficiosos observados cuando se utilizó cualquiera de los dos disolventes como aditivo para la PCR. Teniendo en cuenta los posibles efectos negativos que las altas concentraciones de disolventes orgánicos pueden tener en aplicaciones posteriores sensibles como la secuenciación o la clonación, el efecto potenciador de la adición de BSA es significativo. Con el fin de comprender cómo la BSA podría actuar como cofactor con el DMSO o la formamida, analizamos el efecto de su adición en el rendimiento de la amplificación durante 10, 15, 20, 25 y 30 ciclos de PCR. Este análisis confirmó que la adición de DMSO o formamida, pero no de BSA sola, a la PCR conduce a un aumento del rendimiento (Figura 3). Cuando se utilizó la BSA como coadyuvante con el DMSO o la formamida, se pudo detectar un aumento del rendimiento sólo en los primeros 15 ciclos para todas las plantillas (Figura 3). Este aumento osciló entre un 10,5% (che1P) de aumento de rendimiento y un 22,7% de aumento de rendimiento (cheA1) a lo largo de los primeros 15 ciclos. Además, se observó que la concentración efectiva de BSA aumentaba con el tamaño del fragmento de ADN amplificado hasta una concentración máxima de BSA (10 μg/μl) en la que no se detectó ningún otro aumento del rendimiento. Además, no se observó ninguna disminución del rendimiento incluso con la mayor concentración de BSA añadida en estas condiciones (Figura 4). El efecto potenciador de la BSA sobre el rendimiento de la PCR, limitado por el ciclo, sugirió que esta proteína podría desnaturalizarse con el tiempo, perdiendo así su eficacia. Para comprobar esta hipótesis, se preparó una PCR en la que se combinó DMSO o formamida con BSA en el tampón de reacción inicial a las concentraciones más eficaces determinadas anteriormente, y se ejecutó durante 10 ciclos antes de añadir una solución fresca de BSA (0-10 μg/μl de concentración final). La adición de BSA se repitió a lo largo de 30 ciclos de PCR y el efecto sobre el rendimiento se analizó como se ha descrito anteriormente. Se pudo detectar un aumento sostenido del rendimiento cuando se añadía BSA cada diez ciclos de PCR: por ejemplo, en la amplificación de cheA1, se obtuvo un aumento de casi el 75% del rendimiento de la PCR con respecto al obtenido con el disolvente solo (Figura 4). Los resultados observados en el método que denominamos «paso de PCR con BSA» son coherentes con la hipótesis de que la desnaturalización de la BSA provoca la caída del efecto de aumento del rendimiento después del decimoquinto ciclo de PCR. Los experimentos de control en los que se añadió glicerol o agua estéril destilada cada diez ciclos no aumentaron el rendimiento de la PCR, lo que indica que los efectos de la BSA no se deben a un cambio en el volumen de la reacción o a que la BSA actúe efectivamente como un aglomerante molecular, una propiedad atribuida a algunos de los efectos del glicerol en la PCR. Aunque se desconocen los mecanismos exactos del efecto potenciador de la BSA sobre el rendimiento de la PCR, los datos obtenidos aquí y los descritos en la bibliografía apoyan la hipótesis de que la BSA puede estabilizar la ADN polimerasa y/o contrarrestar los posibles efectos inhibidores de las altas concentraciones de disolventes orgánicos sobre la actividad de la ADN polimerasa. Para la amplificación de cheA4, el fragmento de ADN con mayor contenido de GC utilizado en este estudio (73%), se obtuvo un aumento en el rendimiento de la PCR añadiendo BSA así como DMSO a la PCR, pero también se detectaron múltiples productos de amplificación no específicos (Figura 5). Para resolver este problema, se utilizó a continuación el método de paso de PCR con BSA en combinación con un protocolo de PCR «Touchdown», que ha demostrado previamente que mejora la especificidad de la PCR. Este método produjo una única banda específica, y casi duplicó el rendimiento que se produjo utilizando el protocolo «Touchdown» más los disolventes orgánicos solos (aumento del 96%) (Figura 5). Estos resultados también nos sugirieron una forma de mejorar la eficacia relativamente baja de utilizar el método de mutagénesis dirigida al sitio del plásmido completo descrito en el kit de mutagénesis QuickChange Stratagene (Stratagene) para introducir la mutación en alguna plantilla de ADN rica en GC (en este caso el gen tlp2, un fragmento de 2,5 kb de 66% de GC). Cuando utilizamos el pUCtlp2 como plantilla para la mutagénesis dirigida al sitio, junto con cebadores mutagénicos diseñados para introducir una sustitución de un solo par de bases dentro del tlp2 (cebadores mutagénicos diseñados según el sitio web del fabricante) y el protocolo del fabricante, el fragmento de 5,324 kb correspondiente al pUCtlp2 era apenas visible (Figura 5). Al completar el protocolo de mutagénesis según las instrucciones del fabricante, no se obtuvo ninguna colonia o un pequeño número de colonias (menos de 5 de media) que contenían plásmidos parentales que carecían de la mutación deseada. Este tipo de resultado, caracterizado por un escaso rendimiento de la mutagénesis, ha sido reconocido anteriormente como un escollo común de este método . Sin embargo, cuando se añadió BSA al tampón del fabricante cada cinco pasos, se detectó un producto de amplificación claro (Figura 5). Una vez completado el protocolo del fabricante, se obtuvieron más de 100 colonias con 2/3 portadores de la mutación deseada (determinada por secuenciación). También aplicamos el paso de PCR de BSA en un protocolo de extensión solapada para construir una fusión de proteínas quiméricas entre un gen de A. brasilense (ATM, 650 pb) y la proteína fluorescente cian (CFP) (720 pb). En la PCR de extensión por solapamiento, se utilizan primero dos conjuntos de pares de cebadores para amplificar dos fragmentos de ADN a fusionar que se producen con una secuencia corta que se solapa entre sí. Una tercera amplificación utiliza los productos de amplificación de las primeras reacciones como plantillas, junto con los cebadores inverso y directo más externos para generar construcciones quiméricas . La amplificación de los dos fragmentos iniciales de ADN, ATM y CFP, fue muy eficiente utilizando los protocolos estándar de PCR y no se pudo obtener un aumento significativo utilizando el protocolo del paso de PCR de BSA (Datos no mostrados). Sin embargo, el segundo paso de PCR, el de solapamiento, produjo numerosos productos de amplificación inespecíficos y muy poco, si es que hay alguno, del amplicón quimérico deseado (ATM-CFP; Tabla 1) (Figura 5). Los productos de amplificación inespecíficos desaparecieron cuando se utilizó el método de PCR «Touchdown», pero el amplicón quimérico específico deseado permaneció en una cantidad muy baja, como se detectó por una banda ATM-CFP muy tenue de 1.370 pb (Figura 5). El uso del método de paso de PCR de BSA junto con un protocolo «Touchdown», dio como resultado un aumento del 72% en el rendimiento del amplicón quimérico ATM-CFP (Figura 5). La clonación y secuenciación posteriores confirmaron que se había obtenido la construcción quimérica correcta.
Efectos de DMSO y formamida en la amplificación por PCR de plantillas ricas en GC. Ejemplos típicos de los efectos de la adición de DMSO y formamida a diferentes concentraciones en la amplificación por PCR de plantillas de ADN ricas en GC de 2-3 kb. A) Efecto del DMSO en la amplificación por PCR de che1P (arriba) y tlp2 (abajo), observado mediante electroforesis en gel de los productos totales de la PCR. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron. B) Efecto de la formamida en la amplificación de la PCR de che1P (arriba) y tlp2 (abajo) en experimentos comparables.
Efecto de mejora del rendimiento de la PCR de la BSA cuando se utiliza como coadyuvante con los disolventes orgánicos. Ejemplos típicos de los efectos de la BSA como coaditivo con DMSO y formamida, a diferentes concentraciones, en la amplificación por PCR de plantillas de ADN ricas en GC. A) Efecto del DMSO en la PCR de che1P (izquierda) y efecto combinado del DMSO con 6 μg/μl de BSA (derecha) según se observa en la electroforesis en gel del producto total de la PCR. B) Efectos de la formamida en la amplificación de la PCR de che1P (izquierda) y efecto combinado de la formamida con 6 μg/μl de BSA (derecha) en experimentos comparables.
Efecto de la adición de BSA como coadyuvante con los disolventes orgánicos en el rendimiento de la PCR. El aumento del rendimiento de la PCR se expresa en relación con el rendimiento de la PCR obtenido sin ningún aditivo. En todos los paneles se aplica la siguiente leyenda: línea roja, sólo DMSO (7,5%); línea verde, sólo formamida (2,5%); línea morada, DMSO (7,5%) y BSA (6 μg/μl); azul claro, formamida (2,5%) y BSA (6 μg/μl). A) amplificación por PCR de che1P (392 pb); B) amplificación por PCR de tlp5P (798 pb); C) amplificación por PCR de tlp2 (2.638 pb); D) amplificación por PCR de cheA1 (3.389 pb); E) amplificación por PCR de cheOP1 (7.103 pb).
Efecto de la BSA como coadyuvante de los disolventes orgánicos cuando se añade en los pasos intermedios de la PCR. A) Efecto de la adición de BSA en el rendimiento de la PCR cuando se añade cada diez ciclos para fragmentos de ADN de amplio rango de tamaño (392 pb a 7.103 pb); B) Ejemplo representativo del efecto de la adición de BSA en la amplificación por PCR de cheA1 (3.389 pb) en presencia de DMSO, detectado mediante el análisis de los fragmentos de ADN amplificados por electroforesis en gel.
Efecto de la BSA como coadyuvante con los disolventes orgánicos en diversas aplicaciones de la PCR. A) Un ejemplo representativo del efecto de la adición de BSA (paso de BSA) como coadyuvante del efecto del DMSO en la amplificación por PCR de cheA4 en un protocolo de PCR «Touchdown», detectado por electroforesis en gel. B) Un ejemplo representativo del efecto del protocolo BSA Step utilizado en la mutagénesis dirigida al sitio (QuickChange site-directed mutagenesis, Stratagene) en la amplificación por PCR de pUCtlp2, detectado por electroforesis en gel. C) Un ejemplo representativo del efecto del protocolo BSA Step utilizado en una aplicación de PCR de extensión solapada, fusionando ATM con CFP para producir ATM-CFP, como se detecta por Electroforesis en gel.