La deficiencia de colina atenúa el aumento de peso corporal y mejora la tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob

Abstracto

Estudios anteriores demostraron que el suministro de colina está directamente relacionado con la obesidad y la resistencia a la insulina inducidas por una dieta alta en grasas en ratones. El objetivo de este estudio fue evaluar si el suministro de colina también podría modular la obesidad y la resistencia a la insulina causada por un defecto genético. Ratones ob/ob de ocho semanas de edad fueron alimentados durante dos meses con una dieta deficiente en colina o suplementada con colina. Se evaluó el peso de los tejidos, incluyendo la masa grasa y la masa magra. También se investigó la señalización intracelular, el glucagón y la insulina en plasma, y las pruebas de tolerancia a la glucosa y la insulina. La dieta deficiente en colina redujo el aumento de peso corporal y disminuyó la masa grasa. La deficiencia de colina también redujo el nivel de glucosa en plasma y mejoró la tolerancia a la glucosa y la insulina, aunque el hígado graso se exacerbó. También se observó una mayor actividad lipolítica adiposa, una disminución del glucagón plasmático y una menor expresión del receptor hepático del glucagón con la dieta deficiente en colina. Nuestros resultados demuestran que una dieta deficiente en colina puede disminuir la masa grasa y mejorar la tolerancia a la glucosa en ratones obesos y diabéticos causados por un defecto genético.

1. Introducción

La colina es un importante factor dietético, que interviene en algunos procesos cruciales como la biosíntesis del neurotransmisor acetilcolina y del principal componente de la membrana, la fosfatidilcolina (PC) . La PC puede sintetizarse por la vía de la CDP-colina o a través de la metilación de la fosfatidiletanolamina por la fosfatidiletanolamina N-metiltransferasa (PEMT). La vía de la PEMT sólo es cuantitativamente significativa en el hígado. La colina es también un precursor esencial del neurotransmisor acetilcolina, que actúa a través de los receptores muscarínicos y nicotínicos de acetilcolina. En los últimos años, se ha puesto de manifiesto una posible relación entre la colina y la obesidad/diabetes. Se ha propuesto el potencial de los receptores muscarínicos de acetilcolina como objetivo terapéutico de la obesidad . Recientemente, descubrimos que la deficiencia de PEMT podía proteger a los ratones de la obesidad y la resistencia a la insulina inducidas por una dieta alta en grasas. Sin embargo, esta protección desaparecía cuando se añadía una dosis elevada de colina a la dieta alta en grasas. La vía de la PEMT, seguida del catabolismo de la PC, es la única vía biosintética conocida de la colina en los mamíferos. En los ratones deficientes en PEMT se observó una disminución significativa del contenido de colina en varios tejidos (Li et al., datos no publicados), lo que proporciona una relación directa entre la colina y la obesidad/resistencia a la insulina inducida por una dieta rica en grasas. En el presente estudio, alimentamos a ratones ob/ob con una dieta deficiente en colina (CD) para evaluar si la deficiencia de colina también podría modular la obesidad y la resistencia a la insulina de origen genético.

2. Material y métodos

2.1. Animales y dieta

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales de la Universidad de Alberta de acuerdo con las directrices del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se aclimataron ratones ob/ob de 8 semanas de edad de The Jackson Laboratory durante 1 semana. Se utilizaron 5 ratones en cada grupo. Los ratones tuvieron libre acceso a dietas deficientes en colina (CD) o suplementadas con colina (CS) durante 2 meses. La dieta CD (MP Biomedicals Canada, catálogo nº 901387) contenía un 20% de grasa en forma de manteca de cerdo. La dieta CS consistía en la dieta CD a la que se añadía un 0,4% (p/p) de cloruro de colina. Los ratones se sacrificaron anestesiándolos con isoflurano, seguido de una punción cardíaca.

2.2. Ganancia de peso corporal, medición de la masa magra y de la masa grasa

El peso corporal se midió semanalmente. La masa magra y la masa grasa se analizaron, 2 meses después de que los ratones se pusieran a dieta (premortem), utilizando el sistema EchoMRI.

2.3. Prueba de tolerancia a la glucosa y a la insulina

Prueba de tolerancia a la glucosa: tras un ayuno de 12 horas, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal (i.p.) de 0,5 g de dextrosa/kg de peso corporal disuelta en solución salina esterilizada tamponada con fosfato (PBS). Prueba de tolerancia a la insulina: tras un ayuno de 6 horas, los ratones recibieron una inyección i.p. de 1,0 unidad de insulina (Sigma)/kg de peso corporal en PBS. Las concentraciones de glucosa en sangre se midieron con un glucómetro en los sangrados de la cola antes y en los momentos indicados después de la inyección.

2.4. Mediciones de la actividad del complejo mitocondrial I/II

Las actividades del complejo mitocondrial I y II se determinaron utilizando proteína mitocondrial. Brevemente, para aislar la proteína mitocondrial, las muestras se mantuvieron en hielo y se homogeneizaron en un tampón que contenía 75 mM de sacarosa, 225 mM de sorbitol, 1 mM de EGTA y 0,1% de albúmina de suero bovino sin ácidos grasos en 10mM de Tris-HCl de pH 7,4. El homogeneizado se centrifugó a 600×g durante 15 minutos, y el sobrenadante resultante se centrifugó de nuevo durante 20 minutos a 16.200 rpm. La proteína mitocondrial de los pellets se suspendió en un tampón que contenía 20 mM de Tris y 25 mM de sacarosa (pH7,4) y se conservó a -80°C hasta su utilización. La medición de la actividad se llevó a cabo en un espectrofotómetro durante un periodo de 5min como una disminución de la absorbancia a 600nm debida a la reducción del 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPIP) a ubiquinona-1 en presencia de NADH (sustrato del complejo I) o de succinato (sustrato del complejo II) según corresponda. La reacción se llevó a cabo en presencia de antimicina y cianuro de potasio como inhibidor del complejo III y del complejo IV. La rotenona, como inhibidor del complejo I, también intervino en el tampón de reacción para la actividad del complejo II.

2.5. Histología e Immunoblotting

Para la histología, los hígados o las almohadillas de grasa se diseccionaron en formaldehído al 10% en PBS, y después se realizó la tinción rutinaria de hematoxilina y eosina. Para la inmunotransferencia, tras la homogeneización y centrifugación a 600×g de las muestras de hígado, los sobrenadantes resultantes se sometieron a la determinación de la concentración de proteínas (BioRad) para asegurar que se cargaba una cantidad igual de proteínas en SDS-PAGE. Todos los anticuerpos primarios contra la lipasa sensible a las hormonas (fosfo-HSL/total HSL), la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, (PEPCK), la acetil-CoA carboxilasa (fosfo-ACC/total ACC), y la proteína quinasa activada por AMP (fosfo-AMPK/total AMPK) se compraron a Cell Signaling. Los anticuerpos contra la isoenzima 4 de la piruvato deshidrogenasa (PDK4) y el receptor del glucagón se obtuvieron de Abcam, mientras que el supresor de la señalización de citoquinas 3 (SOCS3) y el PGC-1α se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology. La imagen fue analizada por el software ImageJ.

2.6. Medición de insulina y glucagón en plasma

Las mediciones se realizaron utilizando un kit de ensayo de glucagón e insulina para ratones/ratas (Meso Scale Discovery) basado en las instrucciones de la compañía.

2.7. Análisis estadístico

Los datos se muestran como media ± SD. Las diferencias se evaluaron mediante la prueba t de student. Un valor de 𝑃<0,05 se consideró significativo.

3. Resultados

La dieta deficiente en colina ralentizó significativamente el aumento de peso corporal hasta los 2 meses (Figura 1(a)) sin influir en el consumo de alimentos (ingesta diaria de alimentos 7,21±1,23 g para los ratones CD frente a 7,39±1,31 g para los ratones CS, 𝑃>0,05). Hubo una diferencia significativa en el peso corporal inicial entre los dos grupos (30,42±1,70 g para los ratones CD frente a 26,3±2,26 g para los ratones CS, 𝑃=0,01). La deficiencia de colina no influyó en el peso del corazón, el hígado o el riñón (Figura 1(b)), pero hubo una disminución significativa del peso de la grasa epididimaria y perirrenal (Figura 1(c)). Un análisis más detallado, utilizando imágenes de resonancia magnética, mostró que la deficiencia de colina disminuía la masa grasa de todo el cuerpo y, sin embargo, aumentaba la masa magra, sin importar si se expresaba como masa absoluta o como porcentaje relativo de la masa de todo el cuerpo (Figura 1(d)). La deficiencia de colina aumentó la expresión de la lipasa sensible a las fosfohormonas del tejido adiposo, una forma activada de la enzima (Figura 1(e)). La deficiencia de colina, por otro lado, no cambió la morfología del tejido adiposo (Figura 1(f)).

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Además de influir en el peso corporal, la deficiencia de colina también disminuyó la glucosa plasmática en ayunas (14,3±1,67 frente a 10,8±1,19, 𝑛=5, 𝑃<0,05) y el nivel de glucagón (Figura 2(a)), aunque no tuvo ningún efecto sobre el nivel de insulina plasmática (Figura 2(b)). Se observó una mejora significativa de la intolerancia a la glucosa y a la insulina en los ratones sometidos a una dieta deficiente en colina (figuras 2(c)-2(d)). Para investigar el mecanismo subyacente, se analizaron las enzimas clave para la oxidación de la glucosa. La deficiencia de colina redujo la expresión proteica hepática de PDK4 (Figura 3(a)), un regulador negativo de la actividad de la piruvato deshidrogenasa que controla la entrada de acetil-CoA mitocondrial, lo que indica una mayor utilización de la glucosa. Del mismo modo, se redujo la PGC-1α hepática (un conocido modulador de la PDK4) y la PEPCK (una diana de la PGC-1 α y una enzima clave para la gluconeogénesis) (Figura 3(b)), lo que sugiere una disminución de la gluconeogénesis. Además, investigamos si la mejora de la intolerancia a la glucosa y a la insulina podía estar asociada a la alteración de la inflamación hepática y la función mitocondrial. Ni la expresión proteica de SOCS3 (Figura 3(c)), un marcador de proinflamación, ni la actividad de la citrato sintasa mitocondrial se vieron afectadas (datos no mostrados). Sin embargo, la actividad del complejo II mitocondrial, pero no del complejo I, disminuyó significativamente por la deficiencia de colina (Figura 3(d)). Resulta interesante que la expresión proteica del receptor hepático del glucagón también disminuyera por la deficiencia de colina (Figura 3(e)).

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Aunque mejora la tolerancia a la glucosa, la deficiencia de colina exacerba el hígado graso, apoyado por el análisis histológico y el aumento de la masa de triglicéridos hepáticos (Figura 4(a)). Para comprender los mecanismos que subyacen al hígado graso inducido por la deficiencia de colina, examinamos las enzimas implicadas en la β-oxidación de los ácidos grasos y la lipogénesis. La deficiencia de colina aumentó la actividad de la glicerol-3-fosfo-aciltransferasa hepática (GPAT) (Figura 4(b)) y disminuyó la actividad de la β-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (β-HAD) (Figura 4(c)), una enzima clave de la β-oxidación de los ácidos grasos, lo que indica que se canalizaron más ácidos grasos intracelulares hacia la biosíntesis de lípidos en lugar de su oxidación. Esta noción fue apoyada además por una disminución de la expresión de la fosfo-AMPK y la fosfo-ACC hepáticas (Figura 4(d)), que entonces activa la ACC y aumenta la lipogénesis hepática.

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4. Discusión

En trabajos anteriores, hemos demostrado que la suplementación con colina está relacionada con la obesidad inducida por una dieta alta en grasas y la resistencia a la insulina en ratones deficientes en PEMT . Recientemente, hemos descubierto que la resistencia a la insulina inducida por la colina es específica de la colina, no sólo en ratones de tipo salvaje sino también en ratones deficientes en PEMT (Wu y Vance et al. datos no publicados). En el presente estudio, investigamos el impacto de la privación de colina en ratones ob/ob. Demostramos cinco nuevos efectos de la deficiencia de colina: (1) aumento de la actividad lipolítica adiposa; (2) mejora de la oxidación de la glucosa; (3) disminución de la oxidación de ácidos grasos hepáticos; (4) regulación a la baja de la expresión del receptor de glucagón hepático; (5) reducción de la actividad del complejo II mitocondrial hepático.

4.1. La deficiencia de colina atenúa el aumento de peso corporal

La deficiencia de colina atenúa significativamente la obesidad inducida por una dieta alta en grasas en ratones Pemt-/- y el aumento de peso en ratones ob/ob. Sin embargo, Raubenheimer et al. informaron de que la deficiencia de colina no afectaba al aumento de peso ni al peso del tejido adiposo . La diferencia entre los dos estudios podría deberse a las diferencias en los modelos animales y los protocolos de alimentación. En el estudio de Raubenheimer, los ratones C57Bl/6 fueron alimentados con una dieta alta o baja en grasas durante 8 semanas, pero los ratones sólo recibieron la dieta CD o CS durante las últimas 4 semanas. Nuestros ratones ob/ob fueron alimentados con la dieta CD o CS alta en grasas durante 8 semanas. En la literatura, tanto los ratones ob/ob machos como las hembras se han utilizado ampliamente en estudios metabólicos, como la ganancia de peso corporal y la sensibilidad hepática (y muscular) a la insulina, y no se ha informado de un efecto significativo del género. En nuestro estudio, sólo se utilizaron ratones ob/ob machos.

Nuestro estudio actual demuestra que la colina también puede modular la obesidad de origen genético. Dado que la deficiencia de colina no influyó en el consumo de alimentos, el aumento de la actividad lipolítica adiposa (mayor expresión de la lipasa activa sensible a las hormonas) puede explicar la reducción de la masa grasa y el aumento de peso corporal. Además, no podemos excluir las posibilidades de que la deficiencia de colina pueda aumentar el gasto energético o la expresión de UCP1 en el tejido adiposo marrón y de UCP2/UCP3 en el músculo esquelético, que son factores potenciales que contribuyen a la disminución del aumento de peso corporal.

4.2. La deficiencia de colina mejora la tolerancia a la glucosa

En contraste con la suplementación de colina, que está relacionada con la resistencia a la insulina inducida por una dieta alta en grasas en ratones , la deficiencia de colina mejoró la tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob. Esto concuerda con el estudio de Raubenheimer, en el que los ratones C57Bl/6 sometidos a una dieta alta en grasas con CD presentaron una disminución de los niveles de insulina y una mejora de la tolerancia a la glucosa en comparación con la dieta alta en grasas suplementada con colina . El glucagón plasmático elevado suele encontrarse en pacientes diabéticos de tipo 2 . La inyección de colina aumentó los niveles de insulina y glucagón en plasma en las ratas. Por el contrario, la deficiencia de colina en nuestro estudio disminuyó el glucagón plasmático y la expresión del receptor de glucagón. Dado que en los últimos años los antagonistas del receptor de glucagón han sido propuestos como potenciales fármacos terapéuticos para la diabetes de tipo 2, la disminución de la expresión proteica del receptor de glucagón en los ratones ob/ob con dieta deficiente en colina puede explicar, en cierta medida, la mejora de la tolerancia a la glucosa. La disminución de la expresión hepática de PGC-1α fue concomitante con una regulación a la baja de PEPCK y PDK4, lo que indica una disminución de la producción de glucosa y un aumento de la oxidación de la misma. La regulación a la baja de la actividad de la β-HADH sugería una disminución de la oxidación de los ácidos grasos. Estos procesos iban acompañados de una disminución de la actividad del complejo II mitocondrial, que puede reflejar una respuesta compensatoria a la reducción del estrés oxidativo mitocondrial. Por lo tanto, la mejora de la tolerancia a la glucosa en la CD se debió a la disminución de la producción de glucosa hepática y al aumento de la utilización de la glucosa. Esto podría ocurrir a través de la supresión del receptor de glucagón hepático, que regula la AMPK a través de la adenilato ciclasa, modulando así la PGC-1α y sus objetivos posteriores, como la PEPCK y la PDK4, así como la capacidad de transporte de electrones mitocondrial hepática. Por lo tanto, se necesitan más investigaciones para demostrar si el receptor de glucagón podría ser una nueva diana terapéutica para la diabetes.

4.3. La desconexión entre el hígado graso y la resistencia a la insulina

Se ha demostrado que el hígado graso es un predictor independiente de la obesidad de la diabetes de tipo 2. Se cree que el aumento de los ácidos grasos intracelulares desempeña un papel causal en la resistencia hepática a la insulina . En el presente estudio, la deficiencia de colina exacerbó el hígado graso, en el que se observó una disminución de la actividad de la β-hidroxiacil CoA deshidrogenasa y un aumento de la actividad de la palmitoil-transferasa de glicerol, lo que sugiere un papel de la colina en la modulación del metabolismo de los ácidos grasos. Por lo tanto, la reorientación de los ácidos grasos hacia el almacenamiento de triglicéridos hepáticos puede ser un mecanismo protector inicial para reducir las concentraciones de ácidos grasos intracelulares hepáticos. Sin embargo, la deficiencia de colina a largo plazo está relacionada con la hepatosteatosis, el riesgo de defectos del tubo neural, así como el riesgo de cáncer y la pérdida de memoria, lo que puede limitar el uso de una dieta deficiente en colina como estrategia terapéutica a largo plazo para la obesidad y la resistencia a la insulina.

En conclusión, la deficiencia de colina puede prevenir el aumento de peso corporal y mejorar la tolerancia a la glucosa en ratones ob/ob. Una restricción moderada de la ingesta de alimentos con alto contenido en colina puede beneficiar a los pacientes obesos, prediabéticos y diabéticos. Nuestros resultados sugieren posibles enfoques terapéuticos novedosos.

Abstáculos

Contribución de los autores

G. Wu y L. Zhang contribuyeron a partes iguales.

Declaración de los autores

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención (MOP 89793) de los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria.