No se detectó una regulación al alza de CAP1, pero sí una elevada fosforilación S308/S310, en las células de cáncer de páncreas
Se determinaron los niveles de proteína CAP1 mediante Western blot en un panel de líneas celulares de cáncer de páncreas utilizadas habitualmente {PANC-126, CFPAC-127, AsPC-128 y Mia PaCa-229}, y se compararon con los de la línea celular de páncreas inmortalizada pero no transformada hTERT-HPNE30, que sirve de control. Como se muestra en la Fig. 1A, las cuatro líneas celulares de cáncer expresan niveles abundantes de CAP1 que son comparables a los de las células HeLa, de las que hemos informado previamente que expresan niveles abundantes tanto de CAP1 como de CAP212. Encontramos que las células hTERT-HPNE no transformadas expresaban niveles de CAP1 comparables a los de las líneas celulares de cáncer. También examinamos los niveles de expresión de la otra isoforma de CAP, CAP2, y descubrimos que las células PANC-1 y Mia PaCa-2 tenían una expresión de CAP2 considerablemente aumentada en comparación con la de las células hTERT-HPNE (Fig. 1A).
En las células de cáncer de páncreas se detectó una elevada fosforilación S308/S310 en CAP1, pero no una expresión de CAP1 regulada al alza. (A) El Western blot revela que se detectaron abundantes niveles de expresión de CAP1 comparables a los de las células HeLa en las cuatro líneas celulares de cáncer, y las células de páncreas de control (hTERT-HPNE) tienen un nivel de expresión de CAP1 similar. Los resultados del blot de CAP2 muestran que las células cancerosas PANC-1 y Mia PaCa-2 expresan abundantes niveles de CAP2 que fueron notablemente superiores a los de las células de control hTERT-HPNE. (B) El Western blot revela una elevada fosforilación S308/S310 en CAP1 en las células de cáncer de páncreas PANC-1 y CFPAC-1 en comparación con la de las células de páncreas hTERT-HPNE no transformadas. El anticuerpo específico de fósforo reconoce las señales de fósforo en ambos residuos. Las secuencias alineadas en la parte superior muestran las secuencias que rodean el sitio regulador de fósforo en tándem. Los residuos de serina (S307 & S309 en CAP1 de ratón; S308 & S310 en CAP1 humana) en el sitio en tándem están resaltados en negrita y cursiva (también subrayados). Las señales de fósforo se cuantificaron mediante densitometría, y los resultados de tres experimentos se analizaron mediante la prueba t de Student y se representaron en el gráfico, en el que las barras de error representan la E.S.M. «*» indica P < 0,05 y «**» indica P < 0,01. (C) El tratamiento de las células con el inhibidor de GSK3 6-BIO durante 16 horas redujo notablemente la fosforilación de CAP1 tanto en las células de cáncer de páncreas PANC-1 como en las células hTERT-HPNE, de forma dependiente de la dosis. El 6-BIO también redujo la fosforilación de CAP1 en las células CFPAC-1 de forma similar (no mostrado). GAPDH sirve como control de carga en el Western blot.
Previamente informamos de que GSK3 fosforila S309 en CAP124 de ratón (equivalente a S310 en CAP1 humana; las secuencias alineadas se muestran en la Fig. 1B). Dada la hiperactivación reportada de GSK3 en el cáncer de páncreas25, buscamos la posible elevación de la fosforilación de S308/S310 en CAP1 en las células cancerosas, utilizando un anticuerpo específico de fósforo que reconoce las señales de fósforo en ambos residuos de serina en Western blotting24. Curiosamente, la fosforilación S308/310 fue significativamente elevada en las células cancerosas en comparación con la de las células de control (Fig. 1B, mostrada con datos cuantificados sólo para las líneas celulares PANC-1 y CFPAC-1, pero se obtuvieron resultados similares con las células AsPC-1 y Mia PaCa-2). A continuación, inhibimos GSK3 tratando las células cancerosas con un potente inhibidor de GSK3 6-BIO (6-bromoindirubina-3′-oxime)31 y descubrimos que el tratamiento reducía la fosforilación S308/S310 en CAP1 en las células PANC-1 y CFPAC-1, de forma dependiente de la dosis (Fig. 1C, mostrada sólo para las células PANC-1). El tratamiento con 6-BIO también redujo la fosforilación de CAP1 en las células de páncreas de control. Consistentemente, un inhibidor de GSK3 más selectivo, LiCl32, también redujo la fosforilación de CAP1 en las células PANC-1 y AsPC-1, como se muestra más adelante. Estos resultados apoyan que GSK3 también forma parte de la maquinaria de fosforilación de CAP1 en S308/S310 en las células de cáncer de páncreas. También se observa que el tratamiento de las células cancerosas y de las células de control con 6-BIO condujo de forma consistente a una notable regulación al alza de CAP1, a través de un mecanismo desconocido.
El bloqueo de CAP1 condujo a un aumento de las fibras de estrés, así como a una reducción de la motilidad y la invasión de las células cancerosas
A continuación intentamos silenciar CAP1 para determinar las funciones de CAP1 en las células de cáncer de páncreas. El paradigma de knockdown estable que desarrollamos previamente es compatible con una estrategia de rescate, que permite verificar la especificidad de los fenotipos derivados de la depleción de CAP112,18,24. Utilizando dos construcciones de ARNhc S2 y S3 que se dirigen a secuencias de nucleótidos independientes y que silencian eficazmente CAP1 en células HeLa y de cáncer de mama12,18,24,33, pudimos generar clones estables con un knockdown eficiente de CAP1 en las células PANC-1 y AsPC-1, como se confirmó en el Western blotting (Fig. 2A). Se establecieron dos clones estables de knockdown derivados de PANC-1 (S2-1 y S3-3) y AsPC-1 (S2-3 y S2-7), respectivamente, mediante la selección con neomicina. Sin embargo, los intentos de silenciar CAP1 en las líneas celulares de cáncer CFPAC-1 y Mia PaCa-2 no tuvieron éxito. Las células CFPAC-1 no formaron colonias tras la selección de antibióticos, mientras que ninguna de las aproximadamente dos docenas de colonias estables examinadas presentaba una reducción sustancial de la expresión de CAP1 en las células Mia PaCa-2 (datos no mostrados).
El knockdown de CAP1 en las células cancerosas condujo a un aumento de las fibras de estrés de actina, y a una reducción de la motilidad y la invasión celular. (A) El derribo eficiente de CAP1 en dos clones estables cada uno para las células PANC-1 y AsPC-1 como se confirmó en el Western blot. CAP1 se detectó en el Western blotting, donde GAPDH se utilizó como control de carga. (B) El agotamiento de CAP1 en las células PANC-1 condujo a un aumento de las fibras de tensión de actina. En las células de control que albergan el vector vacío para el ARNhc (Vec), había muy pocas fibras de tensión de actina (indicadas con flechas). Por el contrario, en las células con CAP1 eliminado (S2-1 y S3-3), las fibras de estrés de actina estaban reforzadas (indicadas con flechas) como se observó en la microscopía de fluorescencia tras la tinción con faloidina. (C) El agotamiento de CAP1 redujo la motilidad de las células PANC-1 y AsPC-1, como se detectó en los ensayos de cicatrización de heridas y de migración Transwell (sólo para PANC-1). Para los ensayos de migración en Transwell, se cargaron ~2 × 104 células sin suero durante la noche en cada inserto colocado en un pozo cargado con medio que contenía suero. Después de 16 horas, se puntuaron las células migradas y se recogieron los datos de tres experimentos independientes, que se analizaron mediante la prueba t de Student y se representaron en el gráfico, en el que las barras de error representan la EME. (D) El agotamiento de CAP1 redujo la invasión de Matrigel en las células PANC-1. Los ensayos y la recogida y análisis de datos se llevaron a cabo de forma similar a los de los ensayos de migración Transwell, excepto que las membranas de inserción se recubrieron previamente con Matrigel. «*» indica P < 0,05 en comparación con la de las células de control. (E) Reducción de la EMT en las células PANC-1 eliminadas por CAP1, como indica el aumento de la expresión de E-Cadherina y la reducción de los niveles de expresión de Vimentina en los clones estables eliminados por CAP1. GAPDH sirve como control de carga en los Western blots.
En primer lugar, examinamos las alteraciones morfológicas y del citoesqueleto de actina en las células PANC-1 y AsPC-1 inhabilitadas por CAP1. A diferencia del aumento de tamaño de las células HeLa y de las células de cáncer de mama metastásico que se han eliminado de CAP112,18,24, la eliminación de CAP1 no provocó un aumento notable del tamaño de las células PANC-1 o AsPC-1. A continuación se tiñó el citoesqueleto de actina en las células PANC-1 con faloidina, seguido de microscopía fluorescente. Las células PANC-1 (y las células de cáncer de páncreas en general) parecen tener estructuras de citoesqueleto de actina poco organizadas, especialmente en lo que respecta a las fibras de tensión (Fig. 2B), en relación con las líneas celulares utilizadas habitualmente para los estudios del citoesqueleto de actina, como los fibroblastos HeLa y NIH3T312,24. Sin embargo, las fibras de estrés se hicieron evidentes en las células PANC-1 con CAP1-knockdown en comparación con las células de control (Fig. 2B). Las 26 células de control que albergan un vector vacío examinadas mostraron una presencia muy limitada de fibras de estrés. Por el contrario, 20 de 27 (74,1%) de las células S2-1 y 18 de 23 (78,3%) de las células S3-3 CAP1-knockdown examinadas tenían fibras de estrés notablemente aumentadas, de forma similar a la mostrada en la Fig. 2B. La acumulación de fibras de estrés se ha observado sistemáticamente en otras células con la supresión de CAP112,13, un fenotipo que se cree que se deriva de la pérdida de las funciones de CAP1 en el secuestro de monómeros de actina y en la promoción del recambio de filamentos de actina.
Consistente con el aumento de las fibras de estrés, se ha informado de que la supresión de CAP1 reduce la motilidad en varios tipos de células de mamíferos, incluidas las células cancerosas13,14,17,18,19. También se ha observado que la supresión transitoria de CAP1 en células de cáncer de páncreas reduce la motilidad celular en ensayos de curación de heridas14. Probamos el efecto de la eliminación estable de CAP1 en la capacidad de invasión de las células de cáncer de páncreas, realizando ensayos de curación de heridas, ensayos de migración Transwell y ensayos de invasión Matrigel. La eliminación de CAP1 redujo sustancialmente la motilidad celular en los ensayos de cicatrización de heridas tanto para las células PANC-1 como para las AsPC-1 (Fig. 2C), lo que concuerda con los resultados previamente comunicados14. Las heridas en las células PANC-1 con CAP1-knockdown (tanto S3-3 como S2-1) se curaron sólo marginalmente 24 horas después de la introducción, mientras que en las células de control la brecha se había llenado casi por completo. Efectos similares se observaron en los clones estables de AsPC-1 con CAP1-knockdown S2-3 y S2-7 (Fig. 2C). Los resultados de los ensayos de migración Transwell de las células PANC-1 fueron consistentes con los de los ensayos de curación de heridas, como se muestra en el gráfico de resultados cuantificados en el panel inferior (Fig. 2C). Además, los ensayos de invasión revelan que el agotamiento de CAP1 también redujo la capacidad de las células cancerosas PANC-1 para penetrar e invadir a través de Matrigel (Fig. 2D). Los análisis de la prueba t de Student de los datos recogidos en tres ensayos independientes revelan una reducción significativa de la invasión en las células estables PANC-1 eliminadas por CAP1 (Fig. 2D). Por último, dado que la EMT (Transición Epitelial-Mesenquimal) está relacionada con la capacidad de invasión de las células cancerosas, comprobamos el posible efecto del knockdown de CAP1 sobre la EMT. Efectivamente, las células PANC-1 eliminadas por CAP1 presentaban una regulación al alza de E-Cadherina, lo que indica una reducción de la EMT (Fig. 2E). También analizamos otro marcador de EMT, la Vimentina, y descubrimos que la supresión de CAP1 reducía su expresión (Fig. 2E). En conjunto, estos resultados apoyan un papel necesario para CAP1 en la invasión y EMT en las células cancerosas PANC-1.
La inhibición de GSK3, que suprime la fosforilación de CAP1, redujo la motilidad y la invasión de las células cancerosas
Nuestros hallazgos anteriores sugieren que la fosforilación transitoria es crucial para la función de CAP1 en la regulación del citoesqueleto de actina24. La elevada fosforilación de CAP1 en las células de cáncer de páncreas, en consonancia con la activación de GSK3, sugiere que la fosforilación también puede desempeñar un papel para la función de CAP1 en la invasividad de las células cancerosas. Probamos esta posibilidad mediante la inhibición de GSK3, que suprime la fosforilación de S308/S310 y mientras tanto interrumpe la regulación de CAP1 a través de la fosforilación transitoria en el sitio regulador. Las células PANC-1 se trataron con 6-BIO y se realizaron ensayos de migración e invasión celular. Primero se probaron los efectos de la reducción de la fosforilación S308/S310 en CAP1, mediante el tratamiento con 5 μM de 6-BIO (Fig. 1C). Como se muestra en la Fig. 3A, el tratamiento con 6-BIO redujo significativamente la motilidad de las células PANC-1 tanto en el ensayo de cicatrización como en el de migración Transwell. También confirmamos que el tratamiento de las células PANC-1 y AsPC-1 con otro inhibidor de GSK3, LiCl, redujo la fosforilación de CAP1 así como la motilidad celular en los ensayos de cicatrización de heridas (Fig. 3A,B). Además, el tratamiento con 6-BIO también redujo la invasión en Matrigel de las células PANC-1 (Fig. 3C). Por último, dado que se sabe que GSK3 regula una amplia gama de funciones celulares a través de una plétora de moléculas sustrato, es probable que el efecto de la inhibición de GSK3 sobre la motilidad celular sea un resultado colectivo a través de múltiples dianas de GSK3 que participan en la regulación del citoesqueleto, la polarización celular y la migración34,35. Por lo tanto, probamos y comparamos los efectos de 6-BIO en la reducción de la motilidad celular en las células PANC-1 inhabilitadas por CAP1 y en las células de control. Como se muestra en el gráfico de la Fig. 3D, el tratamiento con 6-BIO redujo significativamente la motilidad de las células de control (Vec) pero no la de las células inhabilitadas para CAP1 (S2-1 y S3-3) en los ensayos de curación de heridas. En conjunto, estos resultados apoyan que la fosforregulación a través de S308/S310 juega un papel importante para que CAP1 promueva la motilidad y la invasión en las células de cáncer de páncreas.
La inhibición de GSK3, que redujo la fosforilación de CAP1, también comprometió la motilidad y la invasión de las células cancerosas. (A) El tratamiento de las células PANC-1 con 6-BIO o LiCl redujo la motilidad celular en los ensayos de curación de heridas y de migración Transwell. El tratamiento con LiCl 100 mM también redujo eficazmente la fosforilación de CAP1 en las células PANC-1. Los ensayos de migración Transwell con células PANC-1 se realizaron de forma similar a la descrita en la Fig. 2, donde NT indica las células sin tratamiento con 6-BIO. (B) El tratamiento con LiCl 100 mM también redujo notablemente la fosforilación de CAP1 en las células AsPC-1, así como la motilidad celular en los ensayos de cicatrización de heridas. (C) El tratamiento de las células PANC-1 con 5 μM de 6-BIO redujo significativamente la invasión de las células cancerosas en los ensayos de invasión con Matrigel. Los ensayos de invasión en Matrigel, incluida la recogida de datos y los análisis, se realizaron de forma similar a la descrita en la Fig. 2D. (D) La eliminación de CAP1 en las células PANC-1 comprometió el efecto de 6-BIO en la reducción de la motilidad celular en los ensayos de curación de heridas. Los clones estables de PANC-1 de control y de CAP1-knockdown se cultivaron durante 16 horas después de la introducción de la herida, y las líneas discontinuas indican los bordes de la brecha inicial. Se cuantificó la motilidad celular, se analizó mediante la prueba t de Student y se representó en el gráfico en el que las barras de error representan la desviación estándar. «*» indica P < 0,05 y «**» indica P < 0,01.
Los mutantes fosforescentes de CAP1 tenían funciones comprometidas en el alivio de las fibras de estrés mejoradas y en la promoción del desarrollo de lamelipodia en las células PANC-1 de CAP1-knockdown
Nuestros hallazgos de las células de CAP1-knockdown apoyan que CAP1 se requiere para la motilidad e invasión de las células cancerosas, y los resultados de la inhibición de GSK3 sugieren que la fosforilación S308/S310 juega un papel clave en las funciones de CAP1. A continuación, empleamos una estrategia de reexpresión para establecer estos casos. La CAP1 de tipo salvaje (WTCAP1) y los mutantes de fósforo que imitan las formas fosforiladas (S307D/S309D; DD) o no fosforilables (S307A/S309A; AA) de CAP1, como se describió anteriormente12,18,24, se reexpresaron de forma estable en las células PANC-1 inhabilitadas para la CAP1 con el fin de probar sus capacidades para rescatar los fenotipos morfológicos y del citoesqueleto de actina. Estos mutantes albergan desajustes en la secuencia diana del ARNhc S3 para evitar el reconocimiento de los ARNm derivados por el ARNhc presente de forma estable en las células knockdown, pero sin alterar ningún aminoácido en CAP112. Pudimos establecer clones estables que reexpresan el CAP1 de ratón WT, o el mutante de fósforo AA y DD, como se confirmó en el Western blotting contra la etiqueta 6xHis (Fig. 4A). Nótese que se han eliminado dos carriles irrelevantes de la imagen original de Western blot (las muestras de esos dos carriles se utilizaron para confirmar la reexpresión de dos mutantes de fósforo de serina 36 en el N-terminal). El conjunto completo del resultado del Western blot original se muestra en la Fig. 1 suplementaria. La morfología de las células que reexpresan el mutante AA (AA-R) o DD (DD-R) se examinó en microscopía de fase, y se comparó con la de las células que reexpresan WTCAP1 (WT-R). Se ha informado de que la supresión de CAP1 en algunos tipos de células de mamíferos, incluidas las células HeLa y las células de cáncer de mama metastásico, provocan un aumento significativo del tamaño de las células12,13,18, un fenotipo que hemos confirmado previamente que es específico de la supresión de CAP112,18. Sin embargo, el knockdown de CAP1 en las células PANC-1 o AsPC-1 no mostró ese efecto. Por el contrario, la reexpresión estable de WTCAP1 o de los mutantes de fósforo en las células eliminadas aumentó significativamente el tamaño de las células (Fig. 4B). Además, la reexpresión de WTCAP1 condujo al desarrollo de lamelipodios de tamaño robusto (indicados con flechas), una estructura subcelular rica en actina filamentosa y que es crítica para impulsar el movimiento direccional de las células (Fig. 4C), mientras que prácticamente ninguna de las células knockdown que albergaban un vector de control vacío desarrolló tales lamelipodios. La reexpresión del mutante AA o DD también estimuló la formación de lamelipodios en cierta medida, pero su tamaño era notablemente menor en comparación con el de las células que reexpresaban WTCAP1 (indicado con flechas en la Fig. 4C). Contamos 200 células para cada tipo de célula, y los porcentajes de células que albergan lamellipodios de gran tamaño fueron 0% (0/200) para las células knockdown (Vec), 14,5% (29/200) para las células WT-R, y 9% (18/200) y 7,5% (15/200), respectivamente, para las células AA-R y DD-R.
Efectos de la reexpresión de WTCAP1 y de los mutantes de fósforo en las células PANC-1 inhabilitadas por CAP1 sobre el citoesqueleto de actina, el tamaño celular y el desarrollo de lamelipodia. (A) Confirmación de la reexpresión de WTCAP1 y de los mutantes de fósforo AA y DD en las células PANC-1 estables con CAP1-knockdown S3-3 mediante Western blotting utilizando el anticuerpo contra la etiqueta 6xHis. Se han eliminado dos carriles irrelevantes de la imagen original de Western blot (mostrada en la Fig. Suplementaria 1); (B) datos cuantificados que muestran un aumento significativo del tamaño celular en las células que reexpresan WTCAP1 o los mutantes de fósforo en las células inhabilitadas para CAP1. Se midieron los tamaños de 50 células por campo utilizando el programa Image-J. Los datos se analizaron mediante la prueba t de Student y se representaron en el gráfico, donde las barras de error indican la desviación estándar. «*» indica P < 0,05 en comparación con las células de control que albergan el vector vacío (Vec-R). (C) Las imágenes de fase muestran que la reexpresión de WTCAP1 o de los mutantes de fósforo estimuló la formación de lamelipodios. Algunas de las células que reexpresan WTCAP1 (WT-R) desarrollaron lamelipodios de gran tamaño (indicados con flechas). La reexpresión del mutante AA (AA-R) o DD (DD-R) también simuló la formación de lamelipodios, pero sus tamaños son notablemente menores comparados con los de las células que reexpresan WTCAP1. No se observó ningún lamelipodio de este tipo en las células de control de CAP1-knockdown que albergaban el vector vacío (Vec-R). (D) La reexpresión de WTCAP1 en las células PANC-1 inhabilitadas por CAP1 redujo las fibras de tensión, mientras que las células que reexpresaban los mutantes tenían mayores fibras de tensión. Las células que reexpresan el mutante DD mimético del fósforo son las que tienen más fibras de estrés. Las flechas indican las fibras de estrés, o la ausencia de las mismas en el caso de las células WT-R.
A continuación examinamos las capacidades de los mutantes de fósforo para aliviar el aumento de las fibras de estrés en las células PANC-1 eliminadas por CAP1. Como se muestra en las imágenes confocales de la Fig. 4D, la reexpresión de WTCAP1 (WT-R) alivió eficazmente el aumento de las fibras de tensión, rescatando así el fenotipo, y las fibras de tensión se disolvieron en grandes áreas indicadas con una flecha. Por el contrario, los mutantes de fósforo fueron menos eficaces en el alivio de las fibras de estrés aumentadas. Las células que reexpresaban el mutante AA tenían fibras de estrés modestamente aumentadas que las células rescatadas por WTCAP1, mientras que las células que reexpresaban el mutante DD parecían tener fibras de estrés aún más aumentadas. Estos resultados son coherentes con nuestros hallazgos anteriores en células HeLa, que sugieren que la CAP1 desfosforilada es la forma «activa» en relación con la CAP124 fosforilada, mientras que se cree que la fosforilación transitoria es necesaria para las funciones celulares óptimas de CAP1. Estos resultados también sugieren que la fosforilación transitoria S308/S310 es importante para que CAP1 regule el citoesqueleto de actina en las células de cáncer de páncreas; la interrupción de la regulación a través de la fosforilación transitoria conduce a defectos en la función de CAP1 en la promoción del recambio de filamentos de actina.
Los mutantes de fósforo de CAP1 tenían defectos que rescataban la reducción de la capacidad de invasión en las células cancerosas inactivadas por CAP1
Dado que el recambio dinámico de los filamentos de actina es la principal fuerza motriz del movimiento celular, a continuación comprobamos en qué medida los mutantes de fósforo rescataban la reducción de la motilidad y la invasión celular en las células PANC-1 inactivadas por CAP1. En primer lugar, realizamos ensayos de migración Transwell, y descubrimos que la reexpresión de WTCAP1 aumentaba significativamente la motilidad celular en comparación con las células de control que albergaban un vector vacío, como se muestra en los resultados cuantificados en el gráfico (Fig. 5A). El mutante AA reexpresado (AA-R), aunque no es tan eficaz como WTCAP1, rescató parcialmente la motilidad celular reducida en los ensayos de migración Transwell. Por el contrario, el mutante DD (DD-R) no pudo rescatar la motilidad celular reducida, y la tasa fue comparable a la de las células CAP1-knockdown que albergaban un vector vacío. Estos resultados son consistentes con las capacidades de rescate de las fibras de estrés mejoradas por WTCAP1 y los mutantes de fósforo. Además, probamos el rescate de la invasión reducida de Matrigel en las células CAP1-knockdown, como se muestra en los resultados cuantificados en la Fig. 5B. De forma similar, WTCAP1 rescató la invasión reducida en las células PANC-1 inutilizadas por CAP1 de forma más eficaz; el mutante AA logró un rescate parcial mientras que el mutante DD literalmente no logró rescatar el fenotipo. Por último, la reexpresión de WTCAP1 en las células inhabilitadas para CAP1 también redujo la expresión de E-Cadherina (Fig. 5C), lo que apoya aún más que CAP1 es necesaria para la EMT en las células cancerosas PANC-1. En conjunto, estos resultados apoyan que la fosforregulación a través del sitio en tándem S308/S310 juega un papel importante para que CAP1 promueva la motilidad y la invasión de las células de cáncer de páncreas.
Efectos de WTCAP1 y de los mutantes de fósforo en el rescate de la motilidad e invasión reducidas en las células PANC-1 eliminadas de CAP1. (A) WTCAP1 y el mutante AA rescataron eficazmente la motilidad reducida en las células PANC-1 inutilizadas por CAP1 en los ensayos de migración Transwell, mientras que el mutante DD no lo hizo. Los experimentos, la recogida de datos y los análisis se llevaron a cabo de forma similar a la descrita en la Fig. 2. Las barras de error representan la media ponderada, y «*» indica P < 0,05 en comparación con las células de control que albergan un vector vacío (Vec-R). (B) WTCAP1 y el mutante AA rescataron eficazmente la reducción de la invasión en Matrigel de las células PANC-1 eliminadas por CAP1, mientras que el mutante DD tampoco lo hizo. Los experimentos, la recogida de datos y los análisis se llevaron a cabo de forma similar a la descrita en la Fig. 2. Las barras de error representan la media ponderada, y «*» indica P < 0,05 en comparación con las células de control. (C) La reexpresión de WTCAP1 también rescató la E-Cadherina regulada al alza en las células PANC-1 eliminadas por CAP1.
Evidencia que apoya que CAP1 media las señales del factor de crecimiento extracelular para controlar la invasividad de las células cancerosas
Se sabe que los estímulos fisiológicos, como los factores de crecimiento PDGF y HGF (Factor de Crecimiento de Hepatocitos)36, estimulan la reorganización del citoesqueleto de actina y la migración celular. Dado que la fosforilación en S308/S310 es crucial para las funciones de CAP1 en la regulación del citoesqueleto de actina y la invasividad de las células cancerosas, estudiamos la posibilidad de que estos estímulos puedan regular la fosforilación de CAP1 y, a través de ello, controlar la reordenación del citoesqueleto de actina y la invasividad de las células cancerosas. Curiosamente, el tratamiento de las células PANC-1 y AsPC-1 sin suero con PDGF redujo la fosforilación de S308/S310 en CAP1, más notablemente en el punto de tiempo de 5 minutos (Fig. 6A,B). El tratamiento de las células de cáncer de páncreas con HGF o suero no tuvo un efecto considerable en la inducción de la desfosforilación de CAP1 (Fig. 2 suplementaria; mostrada para las células PANC-1). Por lo tanto, es probable que la señalización a través de CAP1 sea al menos parcialmente responsable de que el PDGF estimule la reorganización del citoesqueleto de actina y la invasividad de las células cancerosas. Estos resultados también son coherentes con la noción de que la CAP1 desfosforilada es la forma «activa», como sugieren múltiples líneas de evidencia que incluyen la unión de cofilina, la localización subcelular de los mutantes de fósforo y la elevada fosforilación de CAP1 en células cultivadas en suspensión24. Sin embargo, se cree que la fosforilación transitoria en el sitio regulador en tándem, es decir, el ciclo entre las formas fosforiladas y desfosforiladas, es necesaria para las funciones celulares óptimas de CAP124. Las señales de desfosforilación de CAP1 probablemente funcionan en cohorte con las señales de fosforilación de CAP1, para regular las funciones celulares de CAP1 a través de la conducción de la fosforilación transitoria en S308/S310.
PDGF indujo la desfosforilación de CAP1 en células de cáncer de páncreas. (A) El tratamiento de las células cancerosas AsPC-1 sin suero con PDGF indujo la desfosforilación de CAP1 en S308/S310. Las células se cultivaron durante la noche, se privaron de suero durante 24 horas y se trataron con 30 ng/ml de PDGF durante el tiempo indicado. Se prepararon lisados celulares y se utilizaron en el Western blot con un anticuerpo específico de fósforo que detecta señales de fósforo en ambos residuos del sitio regulador en tándem de CAP1. El efecto de desfosforilación fue más significativo en el punto de tiempo de 5 minutos de tratamiento con PDGF. (B) El tratamiento de células PANC-1 sin suero con PDGF también indujo una notable desfosforilación de CAP1, de forma similar a las células AsPC-1. El tratamiento de las células y el Western blotting se llevaron a cabo siguiendo los mismos procedimientos utilizados para las células AsPC-1. GAPDH sirvió como control de carga en Western blot.
La depleción de CAP1 en células de cáncer de páncreas redujo la actividad de FAK pero no causó alteraciones en ERK o en la proliferación celular
Recientemente identificamos un nuevo papel de CAP1 en la regulación de la proliferación de células de cáncer de mama, donde la depleción de CAP1 ejerce efectos dependientes del contexto celular en la proliferación, acompañados de alteraciones consistentes en la actividad de ERK18. Hemos comprobado si CAP1 también puede regular la ERK y la proliferación en las células de cáncer de páncreas. No se detectaron alteraciones significativas en la expresión o fosforilación de ERK en los clones estables de PANC-1 con CAP1-knockdown en comparación con las células de control (Fig. Suplementaria 3A). También llevamos a cabo ensayos de MTT para comprobar la proliferación de las células estables knockdown S2-1 y S3-3 y las comparamos con las células de control (Vec), y detectamos una ligera disminución de las tasas de proliferación celular en las células knockdown (Fig. Suplementaria 3B). Sin embargo, las diferencias fueron estadísticamente insignificantes, con los valores de P comparando la D.O. (a 570 nm) entre las células S2-1 y las células de control en 0,219, y la de las células S3-3 y las de control en 0,223. Estos resultados indican que CAP1 no desempeña un papel significativo en la regulación de la proliferación en las células de cáncer de páncreas. Además, dada la tendencia general de que el paradigma de knockdown estable es propenso a las variaciones de los clones, generamos grupos de células PANC-1 de knockdown estable de CAP1, que se cree que reflejan con mayor precisión los efectos de la depleción de CAP1 en ERK, al evitar la posible influencia del sesgo de selección. Como se muestra en la Fig. 7A, se establecieron grupos de células PANC-1 estables con un eficiente knockdown de CAP1, derivados de las construcciones de ARNhc S2 y S3, tras la selección con neomicina, como se confirmó en el Western blotting. En consonancia con los resultados del uso de clones estables de knockdown, no se detectaron alteraciones notables en la expresión de ERK o su fosforilación en las células de pool de knockdown en comparación con las células de pool de control.
Las células de pool de PANC-1-knockdown de CAP1 tenían una actividad FAK y una adhesión celular reducidas, pero sin alteraciones en ERK. (A) Las células PANC-1 inhabilitadas por CAP1, derivadas de las construcciones de ARNhc S2 y S3, no mostraron una expresión o actividad de ERK alterada en comparación con las células de control que albergaban un vector vacío, tal y como se detectó en el Western blotting. La actividad de ERK se detectó en el Western blotting utilizando un anticuerpo específico contra los sitios Thr202/Tyr204. GAPDH sirvió de control de carga. (B) Se detectó una reducción de la actividad de FAK en las células PANC-1 con CAP1-knockdown en comparación con las células de control. La actividad de FAK se evaluó mediante la fosforilación en Tyr397, utilizando un anticuerpo específico contra el sitio en Western blotting; (C) las células del pool CAP1-knockdown tenían una adhesión celular reducida en los puntos de tiempo probados (45 minutos y 2 horas) después de colocar las células en placas recubiertas de fibronectina. Se colocaron aproximadamente 2 × 104 células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos y se lavaron las células que no se habían adherido en los momentos indicados. Se contó el número de células adheridas en cinco campos aleatorios bajo un microscopio de fase y se tomaron imágenes. (D) Los datos recogidos en tres ensayos independientes de adhesión celular se analizaron mediante la prueba t de Student, y se representaron en el gráfico donde las barras de error representan la desviación estándar. «**» Indica P < 0,01 en comparación con las células de control que albergan el vector vacío.
La eliminación de CAP1 en las células de cáncer de mama causó distintas alteraciones en FAK en las células de cáncer de mama metastásicas y no metastásicas18. También detectamos una reducción de la actividad de FAK, sin alteraciones en los niveles de expresión de FAK, en las células cancerosas de la piscina CAP1-knockdown (Fig. 7B). Basándonos en estos resultados, comprobamos los efectos de la supresión de CAP1 sobre la adhesión celular en ensayos de adhesión, de forma similar a lo realizado anteriormente12,18. Encontramos que las células de las piscinas de CAP1 derivadas de ambas construcciones de ARNhc tenían una adhesión celular notablemente reducida en comparación con las células de control (Fig. 7C). En ambos puntos de tiempo (45 minutos y 2 horas) después de que las células habían sido colocadas en la superficie recubierta de fibronectina, se adhirieron significativamente más células de control en comparación con las células del pool de CAP1-knockdown. Además, más de las células de control adheridas se habían extendido completamente (desarrollaron lamellipodia y las células no se muestran tan brillantes) en comparación con las células CAP1-knockdown (Fig. 7C). Se puntuó el número de células adheridas de tres campos para su comparación, y se cuantificaron los datos de tres experimentos independientes tal y como se representa en el gráfico (Fig. 7D).