Una quimera era una criatura de la mitología griega representada normalmente como un compuesto de león, cabra y serpiente. El uso contemporáneo del término «quimerismo» en el trasplante de células hematopoyéticas deriva de esta idea de entidad «mixta», refiriéndose a alguien que ha recibido un trasplante de tejido genéticamente diferente. Una prueba de quimerismo después de un trasplante de células madre hematopoyéticas implica la identificación de los perfiles genéticos del receptor y del donante y, a continuación, la evaluación del grado de mezcla en la sangre, la médula ósea u otros tejidos del receptor.
La prueba de quimerismo (análisis de injerto) por ADN emplea una metodología comúnmente utilizada en las pruebas de identidad humana y se lleva a cabo mediante el análisis de polimorfismos genómicos denominados loci de repetición corta en tándem (STR). Estos loci consisten en una secuencia central de ADN que se repite un número variable de veces dentro de un locus genético discreto. El término STR, también denominado microsatélites, se refiere al número de pares de bases de una secuencia central de ADN repetida en tándem que oscila entre 2 y 8 pares de bases de longitud. Estos loci presentan alelos que pueden diferir en longitud entre individuos y se heredan como rasgos mendelianos codominantes. Se han identificado loci STR en todo el genoma humano y algunos loci tienen más de 25 alelos.
La información de la secuencia de ADN dentro de las regiones de flanqueo conservadas de los loci se utiliza para crear pares de cebadores de oligonucleótidos para los STR. Estos cebadores se utilizan en la amplificación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de las muestras de prueba. Esta técnica puede amplificar la secuencia del STR hasta mil millones de veces, proporcionando material que puede separarse con un gel electroforético o por electroforesis capilar (CE). La genotipificación se realiza mediante la evaluación del tamaño de los fragmentos de ADN. La referencia a una escalera alélica puede utilizarse para la identificación exacta de los alelos de STR.
El sistema STR/CE basado en la PCR tiene varias ventajas sobre otros métodos de análisis. La amplificación de múltiples loci de STR puede combinarse (multiplexarse) en un solo tubo, permitiendo el análisis de hasta dieciséis loci en una reacción. Dado que se requieren cantidades mínimas de ADN, se pueden utilizar muestras con un bajo número de células, y el pequeño tamaño de los alelos de los STR permite incluso utilizar muestras de ADN degradadas. Los datos digitales facilitan el análisis y el archivo, y el proceso de CE es rápido y rentable. La amplificación por PCR y el análisis de los loci de STR proporcionan un método rápido y fiable para la evaluación del estado del injerto en el entorno del trasplante de células madre.
La tecnología utilizada actualmente permite la co-amplificación y la detección en tres colores de dieciséis loci que se subdividen en 3 conjuntos de 5 o 6 loci que presentan fragmentos amplificados con rangos de tamaño no superpuestos.
Durante el paso de amplificación por PCR, los fragmentos amplificados se etiquetan con tintes fluorescentes. Tras la amplificación por PCR, las muestras se procesan en un sistema de electroforesis capilar (CE).
El análisis de los datos se ve facilitado por un software de análisis de fragmentos que dimensiona los fragmentos de ADN utilizando un carril interno estándar que se ejecuta con la muestra y asigna los genotipos por comparación con una escalera de alelos de STR incluida en la ejecución de CE. Esto proporciona perfiles genotípicos de STR distintos para el donante y para el receptor del trasplante. Los loci STR que son polimórficos (es decir, informativos) entre estos individuos se utilizan para evaluar las cantidades relativas de ADN del receptor y del donante en la muestra posterior al trasplante.
Las muestras analizadas pueden proceder de cualquier material que contenga ADN, incluida la médula ósea, la sangre periférica, los tumores sólidos, el tejido epidérmico, los folículos pilosos, los hisopos bucales y los subconjuntos celulares fraccionados. Dado que la amplificación por PCR de una muestra se realiza rutinariamente con menos de 2 ng de ADN genómico (equivalente a aproximadamente 300 células), las pruebas de quimerismo por este método pueden realizarse con éxito incluso en pacientes con fracaso del injerto, leucopenia grave o a partir de fracciones de subconjuntos de células hematopoyéticas. El análisis de STR se ha utilizado para evaluar el estado de injerto de los pacientes que han recibido un trasplante de células hematopoyéticas, incluidos los pacientes que han recibido unidades dobles de donantes de sangre de cordón umbilical o un segundo trasplante de un donante diferente; así como para confirmar la identidad genética de los supuestos gemelos idénticos, y para detectar el injerto de células maternas derivadas en el útero entre los pacientes con un diagnóstico de inmunodeficiencia combinada grave (SCID). El análisis de STR/CE es un procedimiento rápido, fiable, preciso y reproducible.
Limitaciones del ensayo
- Debe aislarse suficiente ADN de las muestras del ensayo para permitir una amplificación robusta por PCR. Los métodos de aislamiento de ADN deben estar disponibles para manejar muestras con un bajo recuento de células, como las que pueden encontrarse en receptores con fallo del injerto y de subconjuntos de glóbulos blancos clasificados según el linaje por citometría de flujo. Las muestras pueden tener concentraciones demasiado bajas para cuantificarlas por espectrofotometría UV OD260. Las muestras de ADN de 5.000 a 30.000 células aisladas proporcionan de forma fiable una amplificación aceptable. El laboratorio tiene directrices que definen cuándo debe repetirse el análisis de la muestra.
- Con los kits comerciales, muchos loci STR tienen alelos informativos tanto para el donante como para el receptor en el entorno de los donantes no emparentados. Sin embargo, el número de loci STR informativos puede limitarse a tan sólo 3 entre pares de trasplantes de donantes emparentados. Se ha comprobado que los valores cuantitativos que representan la media de tan sólo 3 loci STR son reproducibles.
- Los pacientes con enfermedades malignas pueden tener mutaciones clonales que afectan a determinados loci STR. Un alelo del paciente puede estar ausente en uno o más loci STR cuando se comparan los alelos identificados en la muestra del paciente antes del trasplante frente a la muestra después del mismo. En raras circunstancias, puede detectarse un alelo STR adicional del paciente en un locus específico que no estaba presente en la muestra previa al trasplante. En la mayoría de los casos, estas anomalías se deben probablemente a translocaciones cromosómicas. Los alelos ausentes también podrían ser el resultado de una mutación dentro de las secuencias de flanqueo conservadas del STR donde se encuentran los cebadores de la PCR. Los datos de los loci STR con alelos faltantes o adicionales no se utilizan para la cuantificación.
- Si no se dispone de células del paciente antes del trasplante, se pueden recoger muestras como hisopos bucales, biopsia de piel o raíces de pelo después del trasplante. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que las muestras bucales pueden contener cantidades significativas de células del donante.
- El ensayo no está destinado a la detección de la enfermedad mínima residual.
Indicaciones clínicas de las pruebas de quimerismo en el trasplante de células hematopoyéticas
Documentación rutinaria posterior al trasplante del origen de los glóbulos blancos del donante/receptor en la sangre periférica y/o la médula. La documentación del injerto puede incluir la comprobación de subconjuntos celulares específicos de cada linaje, como las células T CD3 positivas y las células mieloides CD33 positivas.
Evaluar las células del donante/receptor en pacientes con una función inadecuada de la médula.
Definir si la malignidad recurrente o nueva se ha originado a partir de las células del receptor o del donante.
Evaluar los riesgos pronósticos de rechazo y malignidad recurrente.
Documentar la persistencia de las células del donante después del trasplante en pacientes con enfermedad recurrente o antes de la infusión de linfocitos del donante (DLI).
Evaluar si se ha producido un rechazo del injerto en receptores candidatos a un segundo trasplante.
Diferenciar el origen de las células del donante en receptores que han recibido un segundo trasplante con un donante diferente o un trasplante con unidades dobles de sangre de cordón umbilical.
Detectar la presencia de células derivadas de la madre en pacientes diagnosticados de inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
Verificar la identidad genética de gemelos putativos idénticos.
Preguntas frecuentes
Pregunta: ¿Cómo se analizan los donantes múltiples?
Respuesta: Es esencial identificar los loci STR que muestran al menos un alelo STR único para el paciente y para cada donante.
Pregunta: ¿Por qué se comprueba el injerto materno?
Respuesta: Los pacientes diagnosticados con una Inmunodeficiencia Combinada Grave (SCID) pueden haberse injertado con células hematopoyéticas de origen materno en el útero. Algunos subconjuntos celulares de linaje específico (especialmente las células CD3 positivas) pueden ser predominantemente o totalmente de origen materno.
Pregunta: ¿Cuál es la diferencia entre quimerismo «completo» y «mixto»?
Respuesta: El quimerismo «completo» se utiliza para referirse a un paciente que presenta un fenotipo posterior al trasplante en las células hematopoyéticas que es todo de origen del donante.
El quimerismo «mixto» se refiere a un paciente que presenta una mezcla de fenotipo del paciente y del donante en las células hematopoyéticas después del trasplante.
Pregunta: ¿Qué ocurre si no se dispone de una muestra de referencia del receptor?
Respuesta: Hay varias opciones disponibles para obtener una muestra del receptor después del trasplante: se pueden utilizar muestras de toallitas bucales, raíces de pelo o biopsias de piel para una muestra de referencia del receptor. Las muestras de toallitas bucales deben utilizarse con precaución ya que las células del donante pueden estar presentes en cantidades significativas en las muestras bucales.
Pregunta: ¿Qué ocurre si no se dispone de una muestra de referencia del donante?
Respuesta: Si el donante está vivo, obtener una nueva muestra de sangre. Si el donante no está vivo, las muestras posteriores al trasplante deben compararse con la línea de base del paciente antes del trasplante para identificar los alelos STR que se detectan pero que no son de origen del paciente.
Pregunta: ¿Por qué el HLA no es un medio factible para controlar el injerto?
Respuesta: Los donantes de trasplantes se eligen para que sean lo más parecidos posible al receptor. No hay marcadores HLA que diferencien al receptor y al donante cuando son compatibles, y sólo uno o dos si son incompatibles. Además, otras tecnologías suelen ser más sensibles para este propósito que el seguimiento de los alelos HLA no coincidentes; en consecuencia, se utilizan otros loci para proporcionar perfiles únicos.
Pregunta: ¿Qué es un locus STR informativo?
Respuesta: Es un locus con al menos un alelo único para el receptor o el donante. Para ser útil para los cálculos de quimerismo, un locus debe tener alelos únicos para ambos. Puede haber un gran número de loci informativos cuando se utiliza un donante no emparentado para el trasplante, pero muy pocos si se utiliza un hermano emparejado. Debido a las diferencias en las eficiencias de amplificación de los alelos en cada locus, es preferible obtener valores medios o medianos de varios loci para mejorar la precisión. Los resultados de los loci individuales son reproducibles de forma fiable, por lo que incluso un locus puede utilizarse para determinar la tendencia de las muestras secuenciales.
Pregunta: ¿Qué es el locus «amelogenina» que se incluye en algunos paneles de amplificación?
Respuesta: El gen de la amelogenina se encuentra en los cromosomas X e Y. No es un STR, pero muestra diferentes tamaños de productos en los respectivos cromosomas. Esto lo hace útil para determinar el sexo. Se incluye en el panel de cebadores de los proveedores de kits comerciales dirigidos a la comunidad forense, donde la diferenciación X/Y se utiliza ampliamente. Por lo general, no se utiliza para el análisis de quimerismo, ya que no puede proporcionar un marcador femenino único (una muestra masculina siempre incluye un alelo X); tampoco es útil cuando se evalúan muestras después de un trasplante de células madre del mismo sexo.
Pregunta: ¿En qué se diferencia el análisis de quimerismo STR del genotipado?
Respuesta: «Genotipo» se refiere a los alelos particulares presentes en un locus específico. La genotipificación se realiza para establecer los perfiles del receptor y del donante en las pruebas de quimerismo. Cuando se realiza un análisis de quimerismo después de un trasplante de células madre, los perfiles genotípicos del receptor y del donante se comparan con el perfil de la muestra posterior al trasplante para evaluar qué cantidad de cada componente está presente.
El genotipado también se utiliza en otros escenarios como las pruebas forenses y de filiación. Los analistas forenses utilizan los genotipos para identificar el origen de las pruebas en los casos criminales y para excluir a las personas de la consideración de sospechosos. También pueden identificar restos humanos en casos de «John Doe» y en catástrofes masivas. Las determinaciones de filiación se realizan de forma similar para excluir a alguien como posible progenitor encontrando alelos presentes en el niño que no coinciden ni con la madre ni con el padre putativo.
Literatura citada/lectura recomendada
Bryant E, Martin PJ. Documentación del injerto y caracterización del quimerismo tras el trasplante de células hematopoyéticas. En: Forman S, Blune K, Thomas ED, eds. Hematopoietic cell transplantation. 2nd ed. Malden, MA: Blackwell Science, 1998.
Bultler J. Forensic DNA typing. Elsevier Academic Press.