Lesión cerebral subclínica causada por la infección del virus de la gripe H5N1

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Los virus de la gripe humana suelen infectar el sistema respiratorio superior, causando estornudos, secreción nasal y tos, así como fiebre, malestar y artralgia (22). Además, también se han notificado complicaciones neurológicas cuando un nuevo subtipo de virus de la gripe se introduce en la población humana, como ejemplifican las pandemias española (1918) y asiática (1957) (2-4, 6, 10, 18, 22).

En 1997, el virus de la gripe H5N1, originado en las aves de corral, provocó un brote en humanos. Desde entonces, más de 500 personas se han infectado con el virus H5N1 en todo el mundo, con una tasa de mortalidad de aproximadamente el 60% (21). La infección humana por el virus H5N1 se manifiesta generalmente como una neumonía grave, que evoluciona hacia un síndrome de dificultad respiratoria aguda; sin embargo, algunas víctimas del virus H5N1 han experimentado una afectación neurológica (1). Se han detectado ARN y antígenos del virus H5N1 en el cerebro de los pacientes, y el propio virus se ha aislado del líquido cefalorraquídeo (5, 7) Estos datos sugieren que algunos virus H5N1 podrían causar encefalitis en los seres humanos, como ocurrió en las primeras fases de las pandemias española y asiática.

Los hurones representan un modelo de mamífero útil para la infección de la gripe porque son muy susceptibles a la infección con los virus de la gripe y desarrollan algunos de los síntomas de la gripe que se observan en los humanos (8, 12, 14, 16, 19). También se ha informado de la neuroinvasividad del virus de la gripe H5N1 tras la exposición intranasal en un modelo de hurón (23). Por lo tanto, para estudiar los efectos neurológicos a largo plazo de la infección por el virus H5N1, infectamos hurones con virus H5N1 que causan síntomas leves en estos animales y observamos los efectos en el sistema nervioso central (SNC) durante 9 meses. También tratamos de dilucidar la ruta por la que estos virus H5N1 invadieron el SNC.

Se inocularon hurones de seis meses por vía intranasal con 106 PFU del virus A/Hong Kong/483/1997 (H5N1; HK483) o A/Hong Kong/486/1997 (H5N1; HK486). Estos virus se propagaron en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) en medio esencial mínimo suplementado con 0,3% de albúmina de suero bovino. En los días 3, 6 y 12 y en los meses 1, 3, 6 y 9 postinfección (p.i.), se tomaron muestras de tejido para el aislamiento del virus y el examen patológico. Los hurones estaban letárgicos y mostraban signos y síntomas de infección respiratoria durante los primeros 10 días p.i. pero carecían de signos neurológicos apreciables, lo que contrasta con los resultados comunicados anteriormente (23). Se recogieron muestras de tejido de los cornetes nasales, los pulmones, la tráquea, el cerebro, el hígado, el bazo, los riñones, el corazón, el páncreas y la médula espinal y se homogeneizaron hasta obtener una suspensión al 10% con solución salina tamponada con fosfato. El título del virus en cada tejido se determinó mediante ensayos de placa. Los virus se replicaron principalmente en los cornetes nasales, con títulos de virus que alcanzaron de 105 a 106 UFP/gramo de tejido entre 3 y 6 días p.i. (Tabla 1). Los tejidos cerebrales recogidos de hurones infectados con HK483 o HK486 se conservaron en formalina neutra al 10% y se procesaron para su inclusión en parafina. Los tejidos incluidos en parafina se cortaron en cortes de 5 mm de grosor y se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Se cortaron secciones adicionales para la tinción inmunohistológica con anticuerpos policlonales de conejo contra un virus de la gripe H5. El examen histológico reveló la invasión o el daño neuronal, incluida la inflamación del plexo coroideo (Tabla 2). Los hurones infectados con el virus HK486 mostraron evidencias de inflamación no supurativa (Fig. 1a) y expresión de antígenos virales (Fig. 1b) que persistieron durante 12 días; no se detectaron antígenos virales al mes p.i. La encefalitis no supurativa duró 3 meses (Fig. 1c), con cicatrices gliales residuales aparentes a los 6 y 9 meses p.i. en las áreas donde se detectaron antígenos virales en la fase anterior (Fig. 1d). Además, los hurones infectados con HK486 mostraron lesiones macroscópicas en el sistema olfativo a los 12 días p.i. (Fig. 1e y f). Estos resultados sugieren que, aunque los virus H5N1 altamente patógenos afectan principalmente a las vías respiratorias del huésped (1), también pueden producir complicaciones neurológicas. A diferencia del virus HK486, que invadió el parénquima cerebral de los hurones y produjo graves daños en el parénquima, la segunda cepa H5N1, HK483, causó una grave vasculitis no supurativa sin aparentes daños en el parénquima cerebral de los hurones a los 6 días p.i. Aunque el antígeno viral no pudo ser detectado dentro de la vasculatura, la lesión vascular fue evidente, como se caracteriza por la hinchazón endotelial (Fig. 2a, cabezas de flecha), células apoptóticas dispersas (Fig. 2b, cabezas de flecha), y la infiltración intramural de macrófagos (Fig. 2a, flechas) y leucocitos polimorfonucleares (Fig. 2b, flecha). Se encontraron lesiones vasculares en el tálamo, en la unión entre la materia gris y la materia blanca, y en el tronco cerebral. Las muestras de cerebro examinadas a los 1 y 6 meses p.i. mostraban lesiones hemorrágicas indicativas de hemorragia perivascular crónica y repetida (Fig. 2c) en el tálamo, el cerebelo y el espacio subaracnoideo del cerebro anterior (Fig. 2d). Estas observaciones concuerdan con los informes de complicaciones cerebrales hemorrágicas inducidas por el virus de la gripe durante las epidemias anuales (11). La vasculitis cerebral secundaria a la infección viral es relativamente común (17) y es probablemente la causa de la fragilidad de la pared vascular, que conduce a la hemorragia cerebral. Por lo tanto, parece razonable concluir que la infección por el virus H5N1 en humanos puede causar una hemorragia cerebral similar a la observada tras la infección por otros virus neurotrópicos.

Para examinar la ruta por la que los virus H5N1 invaden los cerebros de los hurones, analizamos la distribución de las lesiones cerebrales y la expresión del antígeno viral observada en los hurones infectados con los virus HK483, HK486, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), A/Vietnam/1204/2004 (VN1204) y A/duck/Vietnam/NCVD-18/2004 (NCVD18). Los virus HK213, VN1204 y NCVD18 se propagaron en células MDCK en un medio esencial mínimo suplementado con 0,3% de albúmina de suero bovino. Se inocularon hurones de seis meses por vía intranasal con 106 UFP de virus. Se recogieron tejidos cerebrales en la fase aguda, a los 3 y 6 días después de la infección para VN1204 y NCVD18, y adicionalmente a los 12 días después de la infección para HK213. Los tejidos se procesaron para la tinción H&E y la inmunohistoquímica para el examen histológico. Las lesiones del parénquima cerebral producidas por VN1204, NCVD18 y HK213 se caracterizaban por una encefalitis no supurativa, y el patrón de expresión de los antígenos virales era esencialmente el mismo que el de HK486 (datos no mostrados). Para comprender la distribución tridimensional (3D) de las lesiones cerebrales y de los antígenos virales, los representamos mediante imágenes 3D (TRI/3D-SRF2; Ratoc System Engineering Co., Ltd., Japón) de un cerebro de mangosta amarilla (Cynictis penicillata), cuya arquitectura se asemeja mucho a la del cerebro del hurón (20). Para visualizar la vía olfativa (es decir, la vía sensorial para el sentido del olfato), marcamos las vías nerviosas desde el bulbo olfativo hasta la corteza piriforme en las imágenes 3D como marco de referencia (Fig. 3a, amarillo; véase también la película S1 en el material suplementario). Encontramos tres patrones distintos de lesiones cerebrales, con y sin antígenos virales, causadas por los diferentes virus de la gripe H5N1: las distribuidas sólo a lo largo de la vía olfativa (Fig. 3b y c, línea amarilla discontinua; véanse también las Películas S2 y S3) (HK213 y NCVD18); las detectadas a lo largo de la vía olfativa (Fig. 3d y e, línea amarilla discontinua; véanse también las películas S4 y S5) y en el tronco cerebral (Fig. 3d y e, flechas blancas; véanse también las películas S4 y S5) (HK486 y VN1204); y las de otras zonas (Fig. 3f; véase también la película S6) (HK483). La base para separar el tercer grupo de lesiones de los otros dos grupos es más evidente cuando se examinan las distribuciones de las lesiones desde la parte posterior (Fig. 3g y h, amarillo frente a azul frente a rojo). Estos resultados del mapeo indican que la mayoría de las cepas H5N1 que analizamos invadieron el cerebro a través de la vía olfativa (Fig. 3, línea amarilla discontinua). Una excepción fue la cepa HK483 (Fig. 3f), que se dirigió claramente a la vasculatura cerebral en hurones, produciendo lesiones fuera del sistema olfativo.