Los monocitos/macrófagos CD11c+ promueven la inflamación intestinal crónica inducida por Helicobacter hepaticus a través de la producción de IL-23

H. hepaticus altera el compartimento de fagocitos mononucleares intestinales

La bacteria Gram negativa Helicobacter hepaticus (Hh) es un organismo no invasivo que se encuentra habitualmente en la capa mucosa del tracto intestinal inferior murino. Los animales de tipo salvaje infectados con la bacteria no desarrollan inmunopatología intestinal y sirven como portadores de la infección.21 Sin embargo, los ratones con deficiencias genéticas en la vía IL-10/IL-10R son susceptibles a la infección experimental por Hh y desarrollan una inflamación grave del colon y el ciego (tiflocolitis) asociada a una hiperplasia epitelial.22, 23 Del mismo modo, la infección por Hh de ratones de tipo salvaje con la administración concomitante de anticuerpos monoclonales (mAbs) anti-IL-10R desencadena una inflamación intestinal dependiente de la IL-23 junto con una robusta respuesta de células T efectoras de tipo 1/tipo 17 (Th1/Th17).23 Los ratones infectados con Hh y tratados con anticuerpos anti-IL-10R, pero no los controles no infectados o tratados individualmente, desarrollan características histológicas de colitis en las 2-3 semanas posteriores a la infección (Figura 1a). Los ratones tratados con Hh y anti-IL-10R muestran además una marcada infiltración de leucocitos dentro de la lámina propia (Figura 1b), incluyendo poblaciones predominantes de neutrófilos y monocitos MHCII+ (Figura 1c y Figura Suplementaria S1a online). En el colon no inflamado, los monocitos que entran en la lámina propia desde la sangre dan lugar preferentemente a macrófagos tisulares11 (definidos como células CD11b+ CX3CR1hi Ly6Clo, subconjunto verde), que expresan altos niveles de CD64, MHCII, F4/80 y CD11c (Figura 1d y Figura Suplementaria S1b). Sin embargo, este proceso se altera drásticamente durante la inflamación y observamos la marcada acumulación de monocitos MHCII+ (definidos como células CD11b+ CX3CR1int Ly6Chi, subconjunto rojo) dentro de la lámina propia del colon. Estas células se caracterizan por la expresión de CD64 y MHCII y niveles intermedios de F4/80, CD24 y CD11c (Figura 1c-e y Figura Suplementaria S1a). En estado estable, los monocitos y macrófagos MHCII+ expresan el receptor de manosa (CD206), un marcador asociado a la función antiinflamatoria de los macrófagos.24 Sin embargo, la expresión de CD206 fue menor en los monocitos y macrófagos MHCII+ durante la colitis (Figura 1f), lo que sugiere que no sólo las funciones de los monocitos sino también las de los macrófagos se modificaron durante la inflamación. De hecho, descubrimos que durante la inflamación, los monocitos MHCII+ expresaban mayores cantidades de factor de necrosis tumoral-α y de proteína IL-6, así como de ARNm Nos2 (óxido nítrico sintasa inducible), y que la IL-6 también aumentaba en los macrófagos (Figura suplementaria S1c). La producción de IL-10 por parte de los monocitos MHCII+ y los macrófagos también aumentó durante la inflamación (Figura suplementaria S1c), lo que probablemente refleja una vía de retroalimentación negativa impulsada por la inflamación.

Además de su diferenciación en macrófagos, se ha demostrado que los monocitos MHCII+ también se diferencian en un subconjunto heterogéneo Ly6Clo CX3CR1int relacionado tanto con los macrófagos como con las DC clásicas.11 Entre este compartimento heterogéneo, las DCs CD11b+ (definidas como células CD11c+ CD103- CD11b+ CX3CR1int, subconjunto gris) pueden distinguirse fácilmente de los macrófagos en condiciones homeostáticas. Las DCs CD11b+ expresan MHCII, CD24 y CD11c, pero carecen de expresión de CD64 y F4/80, marcadores comúnmente asociados a los macrófagos (Figura 1d y Figura Suplementaria S1b). Sin embargo, la distinción entre macrófagos y DCs CD11b+ se difuminó durante la inflamación por la aparición de una población que expresa CD64 (Figura 1d,e) y actualmente no está claro cómo estas células se relacionan ontogénica y funcionalmente con los macrófagos en estado estacionario o las DCs CD11b+.

Durante la colitis, la marcada acumulación de monocitos MHCII+ se correlacionó con una frecuencia reducida de macrófagos, DCs CD11b+ y DCs CD103+ (definidas como células CD11c+ CD103+ CX3CR1-, subconjunto naranja) entre las células de la lámina propia CD45+ (Figura 1c,d). Sin embargo, las cifras absolutas indicaban un pequeño aumento de las DCs CD11b+ y CD103+ CD11b+. Por el contrario, el número de macrófagos no cambió y las CD CD103+ CD11b- disminuyeron ligeramente (Figura suplementaria S1a).

En conjunto, la infección por Hh en presencia del bloqueo de IL-10R desencadena una inflamación intestinal asociada a cambios drásticos en el compartimento mieloide. Observamos la acumulación predominante de granulocitos y monocitos MHCII+ dentro de la lámina propia del colon. Además, los monocitos y macrófagos MHCII+ adquirieron un perfil más proinflamatorio.

Los fagocitos mononucleares CD11c+ impulsan la colitis a través de la producción de IL-23

Debido a que la IL-23 se ha identificado como el principal impulsor de la colitis en este modelo,23 investigamos a continuación la relevancia funcional de la producción de IL-23 por parte de los fagocitos mononucleares en el desarrollo de la colitis en el modelo Hh+anti-IL-10R. Por lo tanto, cruzamos ratones que expresaban la proteína verde fluorescente (GFP) y la recombinasa Cre bajo el control del promotor CD11c (codificado por Itgax)25, 26 con ratones que poseían dos sitios loxP que flanqueaban cuatro exones del gen Il23a27 para generar ratones Cd11c-cre.Il23afl/fl (CD11cIL-23-).

Tras la infección con Hh y el tratamiento anti-IL-10R, los ratones CD11cIL-23- mostraron una sorprendente reducción de la colitis en comparación con los ratones CD11cIL-23+, con una menor hiperplasia de la cripta epitelial y una menor infiltración de leucocitos en todo el colon y el ciego (Figura 2a,b). Los ratones CD11cIL-23- tampoco mostraron desarrollo de esplenomegalia (Figura 2c), lo que indica que también estaban protegidos de los signos sistémicos de la enfermedad. La reducción de la patología observada en los ratones CD11cIL-23- no fue consecuencia de una carga bacteriana diferencial, ya que los niveles de colonización Hh fueron similares en los grupos CD11cIL-23- y CD11cIL-23+ (Figura 2d). En consonancia con la reducción de los cambios patológicos, tanto las citocinas efectoras innatas como las adaptativas se redujeron fuertemente en el colon de los ratones CD11cIL-23- tras el bloqueo de Hh e IL-10R (Figura 2e), al igual que la cantidad de la propia IL-23 (Figura 2f).

De acuerdo con su reducida infiltración de leucocitos, los ratones CD11cIL-23- mostraron una menor frecuencia y número de monocitos MHCII- y MHCII+ (Figura 3a) y de neutrófilos (Figura suplementaria S3d) dentro de la lámina propia tras la infección por Hh y el bloqueo de IL-10R en comparación con los compañeros de camada CD11cIL-23+ tratados de forma similar. La menor infiltración de monocitos en los ratones CD11cIL-23- se correlacionó con una mayor frecuencia de macrófagos de la lámina propia, mientras que las frecuencias de DCs CD11b+ y CD103+ no se modificaron y los números absolutos se redujeron (Figura Suplementaria S3d).

Debido a que la IL-23 impulsa la inflamación intestinal a través de efectos directos sobre las células T, promoviendo su acumulación y proliferación en el colon,29 examinamos el compartimento de células T colónicas de ratones CD11cIL-23- y CD11cIL-23+ durante la colitis. Los ratones CD11cIL-23- mostraron una menor frecuencia de células T CD4+ colónicas en comparación con sus compañeros de camada competentes en IL-23 (Figura 3b). Mientras que los ratones CD11cIL-23+ montaron una robusta respuesta efectora Th1/Th17 caracterizada por la aparición de células T mono y doblemente productoras de IL-17A+/IFNγ+, los ratones CD11cIL-23- sólo mostraron una leve inducción de las citoquinas correspondientes (Figura 3c).

En general, la ausencia de colitis en los ratones CD11cIL-23- indica que la producción de IL-23 por los MNP que expresan CD11c desempeña un papel no redundante en la respuesta inflamatoria intestinal.

Los monocitos y macrófagos MHCII+ son la principal fuente de IL-23 tras la infección por H. hepaticus

Para entender mejor la secuencia de eventos asociados con el desarrollo de colitis en ratones deficientes en IL-23, primero monitorizamos la expresión de IL-23 en leucocitos purificados de la lámina propia del colon. La expresión del ARNm de la IL-23a fue detectable de forma consistente 4-5 días después del inicio de la colitis (Figura 4a), lo que sugiere que un subconjunto celular residente en el tejido y/o rápidamente movilizado está implicado en la producción temprana de IL-23 en el colon. Por lo tanto, elegimos este punto de tiempo para los análisis posteriores. A los 4 días después de la infección con Hh y el tratamiento anti-IL-10R, los ratones CD11cIL-23+ mostraron una mayor infiltración de leucocitos en la lámina propia en relación con los ratones de control no infectados (Figura 4b). Esta afluencia se correlacionó con un mayor número de todos los subconjuntos de MNP en el colon (Figura Suplementaria S4a,b), así como un aumento de las frecuencias de monocitos MHCII- y MHCII+ (Figura 4c,d), neutrófilos (Figura 4d), CD103+ CD11b- DCs, y CD103+ CD11b+ DCs (Figura 4e). Sin embargo, las frecuencias de macrófagos y DC CD11b+ entre el total de leucocitos no cambiaron en este punto temporal (Figura 4d).

Para caracterizar mejor los subconjuntos mieloides implicados en la inflamación intestinal dependiente de IL-23, examinamos la expresión de GFP asociada a CD11c-Cre por parte de las células de la lámina propia de ratones CD11cIL-23+. El análisis de las células CD45+ confirmó que la expresión de Cre-GFP estaba restringida a los leucocitos que expresaban CD11c en su superficie celular (Figura 4f), pero se observaba predominantemente en las células CD11chi. Además, la fluorescencia de GFP asociada a Cre sólo se observó en las células MHCII+ (Figura 4g) y, curiosamente, la expresión de ARNm de Il23a estaba restringida a las células Cre-GFP+ (Figura 4h). La mayoría de los MNP de la lámina propia expresan altos niveles de CD11c (Figura 1e y Figura Suplementaria S1b). El análisis de los distintos subconjuntos mieloides en los ratones CD11cIL-23+ reveló que la expresión de GFP asociada a CD11c-Cre se detectó predominantemente entre macrófagos, CD103+ CD11b- DCs, CD103+ CD11b+ DCs, (Figura 4i), y CD11b+ DCs (no mostrado). Además, más de la mitad de los monocitos MHCII+ eran positivos para Cre-GFP, lo que indica que todos esos subconjuntos podrían ser una fuente potencial de IL-23. Por el contrario, la expresión de Cre estaba ausente en los eosinófilos, neutrófilos y monocitos MHCII- (Figura 4i).

Para caracterizar cuál de estos subconjuntos representa una fuente funcional de IL-23 in vivo, evaluamos la expresión de ARNm de Il23a en las poblaciones correspondientes clasificadas por citometría de flujo de ratones CD11cIL-23- y CD11cIL-23+ 4 días después de la infección por Hh en presencia del bloqueo de IL-10R. Llamativamente, la expresión de ARNm de Il23a en las células CD11cIL-23+ estaba restringida en su mayor parte a los monocitos y macrófagos MHCII+, con una baja expresión detectable entre las DCs CD103+ CD11b- y las DCs CD103+ CD11b+ (Figura 4j). Además, la expresión de Il23a tanto en los monocitos MHCII+ como en los macrófagos se redujo notablemente en los ratones CD11cIL-23-, lo que indica que la expresión de CD11c-Cre estaba activa en estos subconjuntos celulares (Figura 4j). La baja expresión de Il23a observada en los monocitos MHCII- (Figura 4k) sugiere que la inducción de IL-23 se produce en la lámina propia durante su maduración local y la adquisición de MHCII.

Como el nivel de expresión de CX3CR1 identifica subconjuntos discretos de MNP, repetimos nuestro análisis en ratones CX3CR1GFP/+. En los ratones no infectados, se detectaron niveles bajos de Il23a constitutiva entre los monocitos MHCII+, los DCs CD103+ CD11b+, (Figura suplementaria S4c,d), y los DCs CD11b+ (Figura suplementaria S4d). Sin embargo, el aumento de la expresión de Il23a a los 4 días de la infección con Hh y el bloqueo de IL-10R sólo se detectó de forma consistente en los monocitos MHCII+ (Figura suplementaria S4d) y en los macrófagos (no se muestra). Durante el curso de la inflamación, se mantuvo una alta expresión de Il23a en los monocitos MHCII+ y su progenie en desarrollo, pero no en los DCs CD103+ (Figura 5a). Entre los subconjuntos CX3CR1int, la expresión de Il23a se restringió aún más a las células CD64+ (Figura 5b).

En conjunto, nuestros datos indican que la inducción de la IL-23 en la colitis está contenida en las células CD11c+ que expresan CX3CR1 y también MHCII y CD64.

Las DCs CD103+ dependientes de Batf3 son prescindibles para la colitis crónica

Las DCs CD103+ CD11b+ se encuentran predominantemente en el intestino delgado del ratón y están casi ausentes en el colon.6 En cambio, la mayoría de las DC colónicas CD103+ son CD11b- y requieren el factor de transcripción Batf3 para su desarrollo.30 Los ratones Batf3-/- carecen, por tanto, de subconjuntos de DC no linfoides CD8α+ y CD103+ CD11b- residentes en el tejido. Como era de esperar, las células CD103+ CD11b- estaban fuertemente reducidas en la lámina propia del colon de los ratones Batf3-/, mientras que las DC CD103+ CD11b+ no estaban afectadas (Figura 6a,b). Para evaluar si las CD CD103+ CD11b- podrían estar implicadas en el desarrollo de la colitis, infectamos a los ratones Batf3-/ con Hh combinado con un tratamiento anti-IL-10R. A las 2 semanas del inicio de la colitis, el número de DCs CD103+ CD11b- seguía estando significativamente reducido en la lámina propia (Figura 6b), pero no se observaron diferencias en la infiltración de leucocitos (Figura 6c) ni en la gravedad de la colitis (Figura 6d) en los ratones Batf3-/ en comparación con sus homólogos de tipo salvaje, lo que indica que las DCs dependientes de Batf3 son prescindibles para la inducción de la inflamación intestinal impulsada por IL-23 en este modelo.

Los macrófagos maduros producen IL-23 en respuesta a la estimulación de H. hepaticus in vitro, pero comparten una redundancia funcional con los monocitos MHCII+ in vivo

Para descifrar la contribución de los macrófagos a la producción de IL-23, generamos macrófagos derivados de la médula ósea (BMDMs) de ratones CD11cIL-23- y CD11cIL-23+. Después de la diferenciación con medio condicionado de células L929, alrededor de la mitad de los BMDMs fueron positivos para Cre-GFP y expresaron CD64, F4/80 y CD11c (Figura Suplementaria S5a). Las BMDM fueron estimuladas in vitro con bacterias Hh vivas en presencia del anticuerpo anti-IL-10R y su respuesta se comparó con los respectivos controles. Sorprendentemente, la estimulación de BMDMs CD11cIL-23+ con Hh dio lugar a la expresión de ARNm de Il23a y esta respuesta se vio reforzada en presencia del bloqueo de la señalización de IL-10R, mientras que Il23a no se expresó en BMDMs no estimulados o en aquellos tratados únicamente con el anticuerpo anti-IL-10R (Figura Suplementaria S5b). Del mismo modo, la infección de ratones con Hh sólo indujo una baja explosión de IL-23 en monocitos y macrófagos in vivo y esta respuesta aumentó fuertemente en ausencia de la señalización de IL-10R (Figura suplementaria S5c).

Los macrófagos del tejido intestinal derivan exclusivamente de los monocitos sanguíneos y no se autorrenovan.8 10 La señalización del receptor del factor estimulante de colonias 1 (CSF-1R) controla la diferenciación de Ly6Chi en monocitos Ly6Clo31 y es necesaria para la maduración y sustitución de monocitos Ly6Clo de tipo residente y macrófagos tisulares, pero es prescindible para la producción de monocitos Ly6Chi o la función inflamatoria.32 Para evaluar las contribuciones relativas de los monocitos MHCII+ y los macrófagos tisulares al desarrollo de la inflamación intestinal dependiente de la IL-23, pretratamos a los ratones CX3CR1GFP/+ con un mAb bloqueador del CSF-1R o con un control de isotipo antes de inducir la colitis. Un grupo de ratones fue analizado en el día 0 (Figura Suplementaria S6a,b), mientras que los ratones restantes fueron tratados con Hh y anti-IL-10R y continuaron recibiendo el tratamiento anti-CSF-1R. A los 4 días después de la infección por Hh y el tratamiento anti-IL-10R, los macrófagos estaban casi ausentes del colon de los ratones tratados con anti-CSF-1R. El compartimento heterogéneo de macrófagos/DC Ly6Clo CX3CR1int también se redujo significativamente en estos ratones (Figura 7a,b y Figura Suplementaria S6c). Aunque el número total de leucocitos colónicos no se modificó (Figura 7c), hubo un aumento de la proporción de granulocitos en estas condiciones (Figura 7d). Curiosamente, el agotamiento de los macrófagos se correlacionó además con el aumento de la expresión de Il23a dentro de la lámina propia en el día 4 (Figura 7e). Sin embargo, la depleción de macrófagos mediada por el anti-CSF-1R a lo largo de todo el curso de la colitis no afectó al número de células inflamatorias que se acumulaban en el colon (Figura 7f) ni a la gravedad de la patología intestinal (Figura 7g) 2 semanas después de la infección por Hh y el bloqueo de la señalización de IL-10R, lo que sugiere que los monocitos MHCII+ y los macrófagos pueden presentar una redundancia funcional durante la inflamación.