El primer papel de Rajskub fue el de Oompa-Loompa en una producción de teatro comunitario de Willy Wonka &la fábrica de chocolate, y su primer papel protagonista fue el de Raggedy Ann. En 1996 apareció en los vídeos musicales de las canciones «The Good Life» de Weezer y «The New Pollution» de Beck.
De 1996 a 1998, tuvo un papel recurrente en la serie de HBO The Larry Sanders Show como la asistente de reservas Mary Lou Collins.
Su papel más notable es el de la analista de sistemas de la UAT Chloe O’Brian en 24, a la que se unió en 2003 al comienzo de la tercera temporada de la serie. Su personaje fue un éxito entre los espectadores y la crítica y fue uno de los pocos miembros del reparto que regresó en la cuarta temporada de la serie. Tras ser una estrella invitada durante dos temporadas, Rajskub se convirtió en miembro principal del reparto en la quinta temporada. Al final de la serie, era la protagonista femenina, sólo superada por Kiefer Sutherland. Su personaje también tuvo el honor de decir las últimas palabras de la serie en el final de la octava temporada. Rajskub y Sutherland aparecieron brevemente como sus 24 personajes en un episodio de 2007, «24 Minutes», de la serie animada de Fox Los Simpson. En agosto de 2013, se anunció que retomaría su papel de Chloe O’Brian en la serie limitada de 2014 24: Live Another Day.
Rajskub fue uno de los miembros del reparto original de Mr. Show. Apareció en The Sketch Show de Kelsey Grammer en Fox Television, El rey de Queens como un personaje llamado Priscilla, y en numerosas películas como Mysterious Skin, Legalmente rubia 2, Sweet Home Alabama, Dude, Where’s My Car? Man on the Moon, Punch-Drunk Love, The Anniversary Party, Firewall, Little Miss Sunshine, vídeos musicales para Beck, Weezer y Sheryl Crow, además de interpretar a una mujer ciega en la película Road Trip.
Rajskub formó parte de un dúo cómico (con Karen Kilgariff) llamado Girls Guitar Club. En 2006, hizo un cameo en «Partings», el final de la sexta temporada de Gilmore Girls, donde interpretó a una trobairitz en busca de su gran oportunidad. (Rajskub había aparecido anteriormente en Gilmore Girls como protagonista femenina de A Film by Kirk, un cortometraje realizado por el personaje Kirk Gleason). Ha sido voluntaria como actriz en el Programa de Jóvenes Narradores. Ha estudiado pintura en el Instituto de Arte de San Francisco.
Rajskub ha sido nominada dos veces al Premio del Sindicato de Actores, una en 2005 y otra en 2007, por su actuación destacada en una serie dramática. Participó como invitada en el episodio de Flight of the Conchords «Prime Minister» como Karen, una fanática de Art Garfunkel. Fue invitada como «Gail the Snail» en un episodio de It’s Always Sunny in Philadelphia titulado «The Gang Gives Frank an Intervention», y repitió el papel en el final de la novena temporada, «The Gang Squashes Their Beefs», y en la decimotercera temporada «The Gang Beats Boggs: Ladies Reboot». En 2009, también apareció en la película Julie & Julia como Sarah, una de las amigas íntimas de Julie Powell. En 2010, Rajskub actuó como monologuista en el programa New York Stand Up Show de John Oliver. En junio de 2010, apareció en el episodio «Lovesick» durante la segunda temporada de la serie estadounidense Royal Pains.
De julio a octubre de 2010, actuó en su espectáculo en solitario, Mary Lynn Spreads Her Legs, en el Steve Allen Theater de Los Ángeles. La crítica F. Kathleen Foley, de Los Angeles Times, escribió que «ese título alegremente vulgar resume el tono general, que a menudo es despreocupadamente obsceno». El espectáculo, escrito por Rajskub con la ayuda del director y desarrollador Amit Itelman, se inspiró en las experiencias de Rajskub con el embarazo, el parto y la maternidad temprana.
En enero de 2011, Rajskub actuó como invitada en el episodio «Our Children, Ourselves» de la segunda temporada de Modern Family de ABC. En el otoño de 2011, Rajskub apareció en la comedia de corta duración How to Be a Gentleman. También en 2011, la serie web de Rajskub, Dicki, comenzó a emitirse en My Damn Channel. Dicki se basa en una serie de personas que Rajskub creció en Michigan y sus alrededores. El personaje del título es una mujer de 40 años que vive en casa de sus padres, hace manualidades y se toma en serio su arte. Dicki ha sido una de las series web más exitosas de My Damn Channel hasta la fecha. La primera temporada concluyó en noviembre de 2011, pero actualmente se está desarrollando una segunda temporada. ¡Rajskub actuó en la edición de junio de 2012 de Don’t Tell My Mother! (Live Storytelling), un programa mensual en el que los famosos comparten historias reales que nunca querrían que sus madres conocieran. Actualmente presenta un podcast en Nerdist Network llamado Kickin’ it Mary Lynn Style.
En 2013, Rajskub apareció en la cuarta temporada de Arrested Development en un papel silencioso pero bien recibido como Heartfire, un personaje del que Rajskub ha dicho que «habla con el corazón, pero no usa ninguna palabra.» Ese mismo año Rajskub también apareció en la serie web All Growz Up con Melinda Hill.
Rajskub apareció en el podcast TV Guidance Counselor de Ken Reid el 27 de marzo de 2015.
En agosto de 2016, Rajskub apareció en el Festival Fringe de Edimburgo en 24 Hours With Mary Lynn Rajskub y fue bien recibida por los fans y la crítica.
En 2017, Rajskub apareció en la primera temporada de la serie de Adult Swim Dream Corp LLC, interpretando al paciente 46 en el episodio «Are You Down With OCD?».
En 2018, Rajskub apareció en Night School junto a Kevin Hart, Tiffany Haddish, Rob Riggle, Taran Killam, Megalyn Echikunwoke, Al Madrigal, Anne Winters, Fat Joe y Keith David.
En 2021, Rajskub lanzó un especial de comedia de 49 minutos llamado Mary Lynn Rajskub: Live from the Pandemic; se puede alquilar o comprar a través de varios servicios de vídeo bajo demanda.