Las metiltransferasas de ADN (MTas) que transfieren un grupo metilo de la S-adenosilmetionina a residuos de adenina o citosina, se encuentran en una amplia variedad de procariotas y eucariotas. La metilación debe tenerse en cuenta a la hora de digerir el ADN con endonucleasas de restricción, ya que la escisión puede bloquearse o verse perjudicada cuando una base concreta del sitio de reconocimiento está metilada.
Metilación procariótica
En procariotas, las MTasas se han identificado con mayor frecuencia como elementos de sistemas de restricción/modificación que actúan para proteger el ADN del huésped de la escisión por la endonucleasa de restricción correspondiente. La mayoría de las cepas de laboratorio de E. coli contienen tres metilasas de ADN específicas del sitio.
- Dam metilasa-metilación en la posición N6 de la adenina en la secuencia GATC (1,2).
- Dcm metiltransferasas-metilación en la posición C5 de la segunda citosina en las secuencias CCAGG y CCTGG (1,3).
- EcoKI metilasa-metilación de la adenina en las secuencias AAC(N6)GTGC y GCAC(N6)GTT.
Algunos o todos los sitios para una endonucleasa de restricción pueden ser resistentes a la escisión cuando se aíslan de cepas que expresan las metilasas Dam o Dcm si el sitio de reconocimiento de la metilasa se solapa con el sitio de reconocimiento de la endonucleasa. Por ejemplo, el ADN del plásmido aislado de E. coli dam+ es completamente resistente a la escisión por MboI, que escinde en sitios GATC.
No todo el ADN aislado de E. coli está metilado en la misma medida. Mientras que el ADN de pBR322 está totalmente modificado (y, por tanto, es completamente resistente a la digestión por MboI), sólo alrededor del 50% de los sitios λ DNA Dam están metilados, presumiblemente porque la metilasa no tiene la oportunidad de metilar el ADN completamente antes de que se empaquete en la cabeza del fago. Como resultado, las enzimas bloqueadas por la modificación Dam o Dcm producirán patrones de digestión parciales con el ADN λ.
Los sitios de restricción que están bloqueados por la metilación Dam o Dcm pueden ser desmetilados clonando su ADN en una cepa dam-, dcm- de E. coli, como dam-/dcm- E. coli competente (NEB #C2925).
Los sitios de restricción también pueden ser bloqueados si un sitio superpuesto está presente. En este caso, parte de la secuencia Dam o Dcm es generada por la secuencia de la enzima de restricción, seguida de la secuencia de flanqueo. Esta situación también debe considerarse cuando se diseñan digestiones con enzimas de restricción.
Metilación eucariótica
Las MTasas CpG, que se encuentran en eucariotas superiores (por ejemplo, Dnmt1), transfieren un grupo metilo a la posición C5 de los residuos de citosina. Los patrones de metilación de CpG son heredables, específicos de los tejidos y se correlacionan con la expresión de los genes. En consecuencia, se ha postulado que la metilación de CpG desempeña un papel en la diferenciación y la expresión génica (4).
Nota: Los efectos de la metilación de CpG son principalmente una preocupación cuando se digiere el ADN genómico eucariótico. Los patrones de metilación CpG no se conservan una vez que el ADN se clona en un huésped bacteriano.
Sensibilidad a la metilación
La siguiente tabla resume la sensibilidad a la metilación para las enzimas de restricción de NEB, indicando si la escisión se bloquea o se deteriora por la metilación Dam, Dcm o CpG si o cuando se superpone a cada sitio de reconocimiento. Esta tabla debe considerarse como una guía del comportamiento de las enzimas enumeradas y no como un indicador absoluto. Consulte REBASE , la base de datos de enzimas de restricción, para obtener información más detallada y ejemplos específicos en los que se basan estas directrices.
- Marinus, M.G. y Morris, N.R. (1973) J. Bacteriol. 114, 1143-1150. PMID: 4576399
- Geier, G.E.y Modrich, P. (1979) J. Biol. Chem. 254, 1408-1413. PMID: 368070
- May, M.S. y Hattman, S.(1975) J. Bacteriol. 123, 768-770. PMID: 1097428
- Siegfried, Z. y Cedar, H. (1997) Curr. Biol. 7, r305-307. PMID: 9115385
Legend
| ● | No sensible | ◆ | Deteriorado |
| ◼ | Bloqueado | ◇ ol | Deteriorado por superposición |
| ◻ ol | Bloqueado por superposición | ◇ scol | Deteriorado por algunas combinaciones de superposición |
| ◻ scol | Bloqueado por algunas combinaciones de superposición | ||
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