4.3. Estructura del receptor nicotínico
El receptor nicotínico del órgano eléctrico y del músculo esquelético de los vertebrados es un pentámero compuesto por cuatro subunidades distintas (a, b, g y d) en la proporción estequiométrica de 2:1:1:1, respectivamente. En las placas terminales del músculo maduro e inervado, la subunidad g es sustituida por la e, una subunidad estrechamente relacionada. Las subunidades individuales son aproximadamente un 40% idénticas en sus secuencias de aminoácidos, surgiendo de un gen primordial común. El receptor nicotínico se convirtió en el prototipo de otros canales iónicos pentaméricos activados por ligandos, entre los que se encuentran los receptores de los aminoácidos inhibidores (ácido g-aminobutírico y glicina) y algunos receptores de serotonina (5-HT3). Cada una de las subunidades del receptor pentamérica tiene una masa molecular de 40 000 a 60 000 daltons. Los 210 residuos aminoterminales constituyen prácticamente todo el dominio extracelular. Le siguen cuatro dominios transmembrana (TM); la región entre el tercer y el cuarto dominio forma la mayor parte del componente citoplasmático. Cada una de las subunidades del receptor nicotínico de ACh tiene una exposición extracelular y otra intracelular en la membrana postsináptica. Las cinco subunidades están dispuestas alrededor de un pseudoeje de simetría para circunscribir un canal localizado internamente,.
El receptor es una molécula asimétrica (14 nm×8 nm) de 250 000 daltons, con la mayor parte del dominio que no abarca la membrana en la superficie extracelular. En las zonas de unión (es decir, la placa terminal motora en el músculo esquelético y la superficie ventral del órgano eléctrico), el receptor está presente en altas densidades (10 000/mm2) en un orden de empaquetamiento regular. Este ordenamiento de los receptores ha permitido reconstruir su estructura molecular mediante imágenes de microscopía electrónica. Se ha identificado en caracoles de agua dulce y salada una proteína de unión a ACh homóloga únicamente al dominio extracelular del receptor nicotínico y se ha caracterizado estructural y farmacológicamente.
Esta proteína se ensambla como un pentámero homomérico y se une a los ligandos del receptor nicotínico con la selectividad esperada; su estructura cristalina revela una organización atómica esperada del receptor nicotínico. Además, la fusión de la proteína de unión a ACh y los tramos transmembrana del receptor dan lugar a una proteína funcional que presenta la apertura del canal y los cambios de estado esperados del receptor. Esta proteína de unión sirve como sustituto estructural y funcional del receptor y ha proporcionado una comprensión detallada de los determinantes que rigen la especificidad del ligando del receptor nicotínico. Los sitios de unión a agonistas se encuentran en las interfaces de las subunidades, pero en el músculo, sólo dos de las cinco interfaces de las subunidades, a g y a d, han evolucionado para unir ligandos. La unión de agonistas, antagonistas competitivos reversibles y la toxina elapid a es mutuamente excluyente e implica superficies superpuestas en el receptor. Las dos subunidades que forman la interfaz de la subunidad contribuyen a la especificidad del ligando. Las mediciones de las conductancias de membrana demuestran que las tasas de translocación de iones son lo suficientemente rápidas (5×107 iones por segundo) como para requerir la translocación de iones a través de un canal abierto en lugar de por un portador rotativo de iones. Además, los cambios en la permeabilidad de los iones mediados por el agonista (típicamente un movimiento hacia el interior principalmente de Na+ y en segundo lugar de Ca2+) se producen a través de un canal catiónico intrínseco a la estructura del receptor. La segunda región transmembrana de cada una de las cinco subunidades forma el perímetro interno del canal. El sitio de unión al agonista está íntimamente acoplado a un canal iónico; en el receptor muscular, la unión simultánea de dos moléculas de agonista da lugar a un rápido cambio conformacional que abre el canal. Tanto la unión como la respuesta de apertura muestran una cooperatividad positiva. Los detalles sobre la cinética de la apertura del canal han evolucionado a partir de las técnicas electrofisiológicas de patch-clamp que distinguen los eventos individuales de apertura y cierre de una sola molécula del receptor y confirman que los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) son canales iónicos pentaméricos ligados que se componen de subunidades que consisten en un dominio extracelular que lleva el sitio de unión del ligando y un dominio de poro iónico distinto. La transducción de la señal es el resultado del acoplamiento alostérico entre los dos dominios, cuya distancia entre el sitio de unión y la puerta del dominio de poro es de 50 Å. Sin embargo, los estudios de unión de los receptores son específicos para los receptores colinérgicos nicotínicos que se han llevado a cabo en epitelios vestibulares aislados de las ranas Rana catesbiana y Rana temporaria. Se presentan pruebas de la presencia de receptores colinérgicos de tipo nicotínico asociados específicamente a las áreas sensoriales, y se estudia la unión de conformaciones de agonistas nicotínicos atípicos que confieren selectividad al subtipo y se concluye que el nAChR tiene un papel crucial en la neurotransmisión excitatoria y constituye una importante diana para fármacos e insecticidas. Diversos subtipos de nAChR con varias combinaciones de subunidades que confieren una selectividad diferencial para los fármacos nicotínicos, y también identificó una familia de genes que codifican proteínas homólogas a la subunidad α del receptor nicotínico de acetilcolina muscular en el genoma de la rata. Estos genes se transcriben en los sistemas nerviosos central y periférico en zonas que se sabe que contienen receptores nicotínicos funcionales. El papel que desempeñan los receptores nicotínicos neuronales que contienen β2 (nAChRs) en la mediación de los efectos secundarios de la nicotina en el feto y el recién nacido. A ratones preñados WT y mutantes que carecen de la subunidad β2 nAChR se les implantaron minibombas osmóticas que administraban agua o una dosis controlada de nicotina. Posteriormente, se produjo una comparición del desarrollo del sistema simpatoadrenal y de los reflejos de respiración y excitación de las crías poco después del nacimiento, un periodo de mayor vulnerabilidad a la exposición a la nicotina. Por otro lado, los neonicotinoides, como el imidacloprid, son agonistas de los nAChR con una potente actividad insecticida. Desde su introducción a principios de la década de 1990, el imidacloprid se ha convertido en uno de los insecticidas más utilizados tanto para la protección de los cultivos como para la salud animal, la base molecular de la resistencia al imidacloprid, se han clonado cinco subunidades de nAChR (Nlα1-Nlα4 y Nlβ1) de Nilaparvata lugens. Una comparación de los genes de las subunidades nAChR de poblaciones sensibles y resistentes al imidacloprid ha identificado una única mutación puntual en una posición conservada (Y151S) en dos subunidades nAChR, Nlα1 y Nlα3. Se ha demostrado una fuerte correlación entre la frecuencia de la mutación puntual Y151S y el nivel de resistencia al imidacloprid mediante una PCR específica para cada alelo. Mediante la expresión de nAChRs híbridos que contienen subunidades α de Nilaparvata lugens y β2 de rata, se obtuvieron pruebas que demuestran que la mutación Y151S es responsable de una reducción sustancial de la unión específica al imidacloprid. Este estudio proporciona pruebas directas de la aparición de resistencia en el sitio diana a un insecticida neonicotinoide, e investiga sobre la naturaleza del sitio de unión del catión-π en el receptor nicotínico y descubre que el receptor nicotínico de acetilcolina es el prototipo de canal iónico activado por ligando. Se ha identificado una serie de aminoácidos aromáticos que contribuyen al sitio de unión del agonista, lo que sugiere que las interacciones catión-π pueden estar implicadas en la unión del grupo de amonio cuaternario del agonista, la acetilcolina. La conformación de las moléculas colinérgicas en los receptores nerviosos nicotínicos, y encuentra una correlación de los análisis de las estructuras cristalinas de los potentes agonistas nicotínicos acetilcolina, acetil-α-metilcolina, lactoilcolina, 1,1-dimetil-4-fenilpiperazina y nicotina permite determinar la conformación de los agonistas colinérgicos relevantes para los receptores nerviosos nicotínicos. La expresión de los receptores de neurotransmisores codificados por los ARNm aislados de tres líneas celulares de glioma humano. Los ovocitos inyectados con ARNm de dos líneas celulares de glioblastoma no mostraron respuestas eléctricas a los diversos neurotransmisores probados.
La modulación de los nAChR por la estricnina descubre que la estricnina es un antagonista potente y selectivo de los receptores de glicina que se encontró que inhibe los receptores musculares (α 1β 1γ δ, α 1β 1γ, y α 1β 1δ) y neuronales (α 2β 2 y α 2β 4) de acetilcolina nicotínica (AcChoRs) expresados en oocitos de Xenopus. La estricnina sola (hasta 500 µmol/L) no provocó corrientes de membrana en oocitos que expresaban AcChoRs, pero cuando se aplicó antes, concomitantemente o durante la superfusión de acetilcolina (AcCho), inhibió rápida y reversiblemente la corriente provocada por AcCho (corriente AcCho). La traducción del ARN mensajero exógeno que codifica los nAChRs produce receptores funcionales en los ovocitos de Xenopus, en este estudio se inyectó en ovocitos de Xenopus el ARN mensajero extraído del órgano eléctrico de Torpedo. Esto condujo a la síntesis e incorporación de receptores funcionales de acetilcolina en la membrana del ovocito. Al ser activados por la acetilcolina, estos receptores de acetilcolina del Torpedo en la membrana del ovocito abrieron canales cuya permeabilidad iónica se asemejaba a la de los receptores nicotínicos de otras células.
La localización de los receptores de acetilcolina (AChR) en la superficie de las células miogénicas en desarrollo de los músculos dorsal anterior y posterior del embrión de pollo en relación con el proceso de inervación se ha estudiado a nivel ultraestructural utilizando un conjugado de peroxidasa de rábano picante-α-bungarotoxina. Se encontraron concentraciones localizadas de AChR en pequeñas regiones de 0,1-0.4 µm de ancho en la superficie de las células miogénicas de músculos de 10 a 14 días, y también se han estudiado los efectos de la acetilcolina y de los agentes que imitan o bloquean sus acciones fisiológicas sobre las concentraciones de guanosina 3′:5′-monofosfato cíclico (GMP cíclico) y adenosina 3′:5′-monofosfato cíclico (AMP cíclico) en rodajas de corteza cerebral, ventrículo cardíaco e íleon de mamíferos. La acetilcolina, y los agentes colinomiméticos con una acción predominantemente muscarínica, como la metacolina, el betanecol y la pilocarpina, indujeron un aumento de la concentración de GMP cíclico o una ligera disminución de la concentración de AMP cíclico, en los tres tejidos estudiados.
Se investigaron las propiedades funcionales y la localización celular del receptor neuronal humano α7 AcChoR (α7 AcChoR) y su forma mutada L248T (mut) expresándolos solos o como fusiones de genes con la versión mejorada de la proteína verde fluorescente (GFP). Los ovocitos de Xenopus inyectados con ADNc de la subunidad salvaje, mutα7 o quimérica expresaron receptores que activaron corrientes de membrana cuando se expusieron al AcCho. Como ya se sabe, las corrientes de AcCho generadas por los receptores wtα7 decaen mucho más rápido que las provocadas por los receptores mutα7. La interacción de los receptores nicotínicos β2 y las vías dopaminérgicas en el control de la locomoción espontánea, y encuentra que la acetilcolina (ACh) es un conocido modulador de la actividad de las neuronas dopaminérgicas (DAérgicas) a través de la estimulación de los nAChRs. Sin embargo, la composición de subunidades y la localización específica de los nAChRs implicados en la locomoción mediada por la DA siguen sin establecerse in vivo. Los ratones que carecen de la subunidad β2 de los nAChRs (β2KO) muestran una llamativa hiperactividad en campo abierto, lo que sugiere un desequilibrio en la neurotransmisión de DA. Sin embargo, la mutación dentro del dominio M2 del receptor nicotínico convierte a la 5-hidroxitriptamina de antagonista a agonista, el estudio se realizó sobre los efectos de la 5-hidroxitriptamina (5HT) en los receptores nicotínicos neuronales homoméricos (nAcChoR) expresados en oocitos de Xenopus después de la inyección de ADNc que codifica la subunidad de pollo de tipo salvaje. El AcCho provocó grandes corrientes que fueron reducidas por la 5HT de forma reversible y dependiente de la dosis, con una concentración media inhibitoria y un coeficiente de Hill. Aunque el estudio del receptor colinérgico de los linfocitos T citotóxicos y los agonistas colinérgicos tienen la capacidad de los linfocitos sensibilizados de lesionar las células portadoras de los aloantígenos sensibilizantes, el receptor colinérgico de la población de linfocitos atacantes se ha estudiado con la manipulación farmacológica de un sistema in vitro que cuantifica la lesión mediada por las células atacantes sensibilizadas sobre las células diana.