Visitantes de EE.UU. y Canadá, soliciten una MUESTRA GRATUITA de nuestro Kit de extracción de ADN vegetal basado en CTAB SYNERGY™ 2.0 AQUÍ.
El aislamiento de ADN de tejidos vegetales puede ser muy desafiante ya que la bioquímica entre especies vegetales divergentes puede ser extrema. A diferencia de los tejidos animales, donde el mismo tipo de tejido de diferentes especies suele tener características similares, las plantas pueden tener niveles variables de metabolitos y biomoléculas estructurales. Los polisacáridos y los polifenoles son dos clases de biomoléculas vegetales que varían mucho entre especies y son muy problemáticas a la hora de aislar el ADN. Los polisacáridos y polifenoles contaminantes pueden interferir con las manipulaciones del ADN después del aislamiento.
Existen métodos que eliminan eficazmente los polisacáridos y polifenoles de las preparaciones de ADN vegetal. El uso de CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio), un detergente catiónico, facilita la separación de los polisacáridos durante la purificación, mientras que los aditivos, como la polivinilpirrolidona, pueden ayudar a eliminar los polifenoles. Los tampones de extracción basados en CTAB se utilizan ampliamente para purificar el ADN de los tejidos vegetales.
Una opción para purificar el ADN utilizando CTAB aprovecha que los polisacáridos y el ADN tienen diferentes solubilidades en CTAB dependiendo de la concentración de cloruro de sodio. A mayores concentraciones de sal, los polisacáridos son insolubles, mientras que a menores concentraciones el ADN es insoluble. En consecuencia, ajustando la concentración de sal en los lisados que contienen CTAB, los polisacáridos y el ADN pueden precipitarse de forma diferencial.
Los polifenoles son compuestos que contienen más de un anillo fenólico (por ejemplo, el tanino), una estructura que se une muy eficazmente al ADN. Se encuentran de forma natural en las plantas, pero también se generan cuando las plantas sufren daños en los tejidos (pardeamiento). Tras la homogeneización de los tejidos vegetales, los polifenoles son sintetizados por la polifenoloxidasa liberada. La adición de polivinilpirrolidona impide la interacción entre el ADN y los anillos fenólicos al ligar los polifenoles.
Los protocolos basados en el CTAB suelen funcionar muy bien, pero una desventaja importante es que las extracciones con cloroformo se utilizan habitualmente para separar las moléculas orgánicas solubles del ADN. Como el cloroformo es cancerígeno, muchas instituciones desaprueban su uso. Por lo tanto, OPS Diagnostics ha desarrollado un método alternativo que evita el cloroformo; se puede encontrar en la página del Synergy™ Plant DNA Extraction Kit.
Materiales
- Tampón CTAB: Bromuro de cetiltrimetilamonio al 2%, polivinilpirrolidona al 1%, Tris-HCl 100 mM, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, o tampón de extracción CTAB
- Centrífuga (hasta 14.000 x g)
- Solución de RNasa A
- Isopropanol
- Etanol al 70%
- Tubos de centrífuga de 2 ml
- SpeedVac
- Tampón TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA)
Método
Las muestras de plantas pueden prepararse triturando criogénicamente los tejidos en un mortero y una maja después de haberlos enfriado en nitrógeno líquido. Las plantas liofilizadas pueden triturarse a temperatura ambiente. En cualquier caso, un polvo fino es lo mejor para extraer el ADN.
- Por cada 100 mg de tejido homogeneizado, utilice 500 µl de tampón de extracción CTAB. Mezclar y agitar a fondo. Transferir el homogeneizado a un baño de 60°C durante 30 minutos.
- Tras el periodo de incubación, centrifugar el homogeneizado durante 5 minutos. a 14.000 x g.
- Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo. Añadir 5 µl de solución A de RNasa e incubar a 37°C durante 20 minutos
- Añadir un volumen igual de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Vortex durante 5 segundos y luego centrifugar la muestra durante 1 minuto a 14.000 x g para separar las fases. Transferir la fase superior acuosa a un nuevo tubo. Repita esta extracción hasta que la fase superior sea clara.
- Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Precipitar el ADN añadiendo 0,7 volúmenes de isopropanol frío e incubar a -20°C durante 15 minutos.
- Centrifugar la muestra a 14.000 x g durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante sin alterar el pellet y posteriormente lavar con 500 µl de etanol al 70% frío. Decantar el etanol. Eliminar el etanol residual secándolo en un SpeedVac.
- Secar el pellet el tiempo suficiente para eliminar el alcohol, pero sin secar completamente el ADN. Disolver el ADN en 20 µl de tampón TE (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). Puede ser necesario calentar el pellet para que se disuelva.
Protocolo opcional:
El uso de columnas de centrifugado de sílice puede producir un ADN de mayor calidad. Para un protocolo opcional, haga clic aquí.