¿Está buscando comenzar a utilizar muestras de sangre en su investigación traslacional? Tal vez usted está interesado en el cáncer de mama metastásico, o de pulmón de células no pequeñas. O tal vez los retos y limitaciones de las muestras de tumores sólidos le han hecho pensar… es el momento.
¿Y ahora qué?
Examinemos más de cerca el rendimiento del ADN, y la realidad de trabajar con el ADN libre de células del plasma. El ADN libre de células (o cfDNA) se refiere a todo el ADN no encapsulado en el flujo sanguíneo. Una parte de ese ADN libre de células procede de un clon tumoral y se denomina ADN tumoral circulante (o ctDNA). El cfDNA son fragmentos de ácido nucleico que entran en el torrente sanguíneo durante la apoptosis o la necrosis. Normalmente, estos fragmentos son limpiados por los macrófagos, pero creemos que la sobreproducción de células en el cáncer deja una mayor cantidad de cfDNA. Estos fragmentos tienen una longitud media de unas 170 bases, una vida media de unas dos horas y están presentes tanto en la fase inicial como en la avanzada de la enfermedad en muchos tumores comunes, como los de pulmón de células no pequeñas y los de mama. Dicho esto, la concentración de cfDNA varía enormemente, produciéndose entre 1 y 100.000 fragmentos por mililitro de plasma.
Si lleva un tiempo en el espacio de la secuenciación de nueva generación, es posible que quiera conocer la sensibilidad y la especificidad. Hemos demostrado una alta sensibilidad y especificidad para las variantes con una frecuencia superior al punto uno por ciento con 20 nanogramos de ADN de entrada, y superior al punto cinco por ciento con 5 nanogramos . Para ver más sobre cómo hacerlo, consulte nuestro vídeo sobre ensayos de cfDNA. Es posible que haya oído hablar del uso de cfDNA para los análisis en el límite de detección del punto cero uno por ciento. Aunque existe la tecnología para alcanzar el 0,01% (gota digital, por ejemplo), hay un límite biológico del que tenemos que hablar.
De una muestra de sangre de 10 mL, utilizando el kit de aislamiento de ADN libre de células Applied Biosystems MagMAX, obtenemos rutinariamente unos 20 nanogramos de cfDNA, o alrededor de 6 moléculas utilizables para el análisis. Algunos cálculos rápidos nos muestran que con un límite de detección del 1%, podemos esperar unas 25 moléculas. Al 0,1% sólo se espera que haya 2-3 moléculas. Esto significa que por debajo del 0,1% puede no haber ninguna molécula presente para el análisis. Recuerde también que las concentraciones de cfDNA son muy variables. Pueden ser muy bajas en etapas críticas como la recurrencia temprana o el desarrollo de resistencia, donde muchos investigadores se centran ahora. Para aislar con éxito 20 nanogramos de ADN del plasma sanguíneo, existen métodos manuales y automatizados en función de sus necesidades de rendimiento.
Con el ADN en la mano, su investigación dicta qué camino tomar en este punto. Podría elegir la PCR digital para los estudios de seguimiento de la recurrencia. Para la investigación en la selección de la terapia, puede ser preferible un ensayo de secuenciación de próxima generación. Dondequiera que le lleve su investigación de biopsia líquida, podemos ayudarle a llegar allí con soluciones completas para el análisis de cfDNA, desde unos pocos objetivos hasta ensayos multigénicos.
Espero que le hayamos dado algunas cosas en las que pensar cuando considere el uso de ADN libre de células en su laboratorio. Pero estoy seguro de que tendrá algunas preguntas. Así que envíe sus preguntas en thermofisher.com/ask y suscríbase a nuestro canal para ver más vídeos como este. Y recuerde, en caso de duda, ¡simplemente haga la prueba de secuenciación!