Abstract
La combinación de trombofilia y embarazo aumenta el riesgo de trombosis y el potencial de resultados adversos durante el embarazo. El factor de riesgo hereditario más importante para la trombofilia es la resistencia a la proteína C activada (APCR), una mala respuesta anticoagulante de la APC en la hemostasia, que está causada principalmente por un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) heredado, el factor V G1691A (FV Leiden) (FVL), denominado APCR heredado. Cambios en los niveles de los factores de coagulación: FV, FVIII y FIX, y los factores anticoagulantes: proteína S (PS) y proteína C (PC) pueden alterar la función de la APC causando una APCR adquirida. La protrombina G20210A y la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) C677T son SNPs protrombóticos que, en asociación con el APCR, también pueden aumentar el riesgo de trombosis entre los caucásicos. En este estudio, se demostró una correlación entre un fenotipo APCR adquirido y un aumento de los niveles de los factores V, VIII y IX. Las mutaciones trombofílicas entre nuestra cohorte de mujeres embarazadas con APCR adquirido son relativamente comunes pero no parecen ejercer un efecto adverso grave en el embarazo.
1. Introducción
El embarazo aumenta el riesgo de trombosis. El fenotipo APCR se ha asociado con el tromboembolismo venoso (TEV), la principal causa de muerte materna en los países desarrollados.
En condiciones normales, la APC inactiva la proteína coagulante activa FV(a) escindiendo en una secuencia ordenada sitios específicos de FV(a). El primer sitio de escisión es la arginina (Arg) 506, y el segundo es (Arg) 306 seguido de (Arg) 679 . Las mutaciones en el gen FV se han relacionado con el APCR. La FVL se registra en cerca del 90% de los pacientes con APCR en la población general . Otros SNP en el gen del factor V que pueden contribuir a la APCR heredada, ya sea de forma independiente o en asociación con la mutación del FVL, son el Arg306 de Cambridge, el Arg306 de Hong Kong, el Arg679 y los polimorfismos del haplotipo (H) R2 y R3. Sin embargo, los informes sobre la contribución de estas mutaciones al fenotipo de la APCR son contradictorios.
La fisiopatología que subyace a la APCR no causada por la mutación FVL aún no se comprende completamente. En diferentes estudios, se ha sugerido que los factores adquiridos podrían ser la causa de la APCR en ausencia de FV Leiden . Varios factores de coagulación pueden afectar al tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa). La literatura anterior sugería una posible correlación positiva entre los niveles de los factores V, VIII y IX y el APCR adquirido. Los niveles de proteína S y proteína C pueden (o pueden) afectar al APCR adquirido, pero su influencia en la resistencia parece estar todavía dentro del rango de los niveles normales .
Otros SNPs conocidos asociados con la trombofilia y los resultados adversos durante el embarazo son la protrombina G20210A y la MTHFR C677T .
La protrombina G20210A se asocia a un aumento del nivel de la proteína protrombina (FII) en el plasma y a un aumento resultante de 3 veces en los eventos trombóticos. La mutación de la protrombina G20210A parece aumentar el riesgo de trombosis en las mujeres embarazadas en aproximadamente diez veces con el riesgo de desarrollar complicaciones obstétricas aumentado en cuatro veces.
La MTHFR C677T se ha asociado con complicaciones obstétricas y con defectos de nacimiento .
En un estudio anterior de este laboratorio, identificamos SNPs conocidos y nuevos en un pequeño número de sujetos con APCR determinado mediante la prueba de Coatest modificada que no tenían la mutación FVL .
Los principales objetivos de este estudio fueron (1) determinar y comparar los niveles de los factores V, VIII y IX en los grupos de APCR adquirida, APCR heredada y APCR negativa, (2) comparar la frecuencia de resultados adversos en los grupos APCR-positivos (adquiridos y heredados) y APCR-negativos, y (3) determinar la frecuencia de resultados adversos del embarazo, asociados con mutaciones trombofílicas distintas de la mutación FVL en nuestra cohorte de estudio (𝑛=907). Los resultados adversos del embarazo observados en este estudio incluyeron (previamente) la pérdida temprana recurrente del embarazo (REPL), la preeclampsia (PET) y la restricción del crecimiento intrauterino (IUGR). hipertensión inducida por el embarazo (PIH), (IUFD) muerte fetal intrauterina, y bajo peso al nacer (LBW).
2. Materiales y métodos
2.1. Sujetos
Se obtuvo la aprobación ética para el estudio por parte del Comité de Ética de la Investigación, y se obtuvo el consentimiento por escrito para la recogida de muestras de las 907 mujeres embarazadas incluidas en este estudio que acudieron al cribado gestacional ambulatorio de rutina en la clínica prenatal del University College Hospital, Galway, (UCHG). La tabla 1 detalla los datos demográficos de los sujetos del estudio.
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| SVD: Parto vaginal espontáneo; AV: vaginal asistido; CS: cesárea. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Se recogieron muestras de sangre (heparina de litio y EDTA) de los sujetos entre las semanas 16 y 24 de gestación. En este segundo trimestre del embarazo, se ha demostrado que la variación de los factores de coagulación es escasa o casi nula, lo que resulta apropiado para la evaluación del estado de la APC . El análisis del estado de la CCA antes o de las 8 a las 12 semanas de gestación, o con mayor frecuencia durante el embarazo, habría determinado un índice de CCA estable más preciso; ésta es una limitación del presente estudio. El análisis de laboratorio de la mala respuesta anticoagulante a los CCA se basa en un ensayo de tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa). Un ratio reducido refleja una menor tasa de inactivación. El cociente de corte utilizado para determinar un APCR positivo para este estudio fue un valor inferior o igual a 2,1 segundos (s). Este valor fue determinado por el departamento de hematología y es de uso clínico en el UCHG. La relación de corte utilizada para determinar el APCR puede variar en sensibilidad y especificidad dependiendo de la metodología, el equipo y la tecnología utilizados en los diferentes laboratorios.
2.2. Estado de APC mediante la prueba clásica de Coatest para identificar las muestras de APCR adquiridas
Las muestras de sangre se centrifugaron a 4.000 rpm durante 5 minutos, y las alícuotas de plasma pobre en plaquetas se congelaron a -80°C hasta que se realizó el ensayo. El plasma se incubó con un volumen igual de reactivo aPTT durante 5 minutos a 37°C. La coagulación se inició mediante la adición de CaCl2, y los tiempos de coagulación se expresaron como una relación del tiempo de coagulación en presencia de APC dividido por el tiempo de coagulación en ausencia de APC.
2.3. Estado de APC mediante la prueba Coatest modificada para identificar muestras de APCR heredadas
Las muestras de sangre se diluyeron primero 1 en 5 con plasma deficiente en factor V que contiene un neutralizador de heparina, y luego se ensayó como se describe para la prueba Coatest clásica de APCR. La adición del plasma deficiente en factor V corrige las deficiencias de otras proteínas de la coagulación, neutraliza las concentraciones terapéuticas de heparina y elimina el efecto de algunos inhibidores del lupus . La APCR en presencia de plasma deficiente en factor V se evaluó utilizando el kit Coatest APCR y plasma deficiente en factor V (Chromogenix).
2.4. Extracción de ADN
Se extrajo el ADN de las muestras de sangre de todos los sujetos APCR (𝑛=140) y de las muestras de control (APCR negativo 𝑛=31) utilizando una modificación del protocolo CF(12)m-PCR de Ortho-Clinical Diagnostics, Amersham, Reino Unido. Se realizó un análisis espectrofotométrico de la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro Heλios α (Unicam Ltd., Inglaterra) para cada muestra de ADN, y se determinó que el rendimiento medio del ADN era de 30 ng/μL.
2.5. Cribado de mutaciones
Se aplicó el análisis enzimático de restricción por PCR (PCR-REA) para identificar G20210A en el gen FII, C677T en el gen MTHFR, y las mutaciones FVL, FV Cambridge, FV Hong Kong, y el haplotipo (H) R2, alelo en el gen FV utilizando modificaciones de métodos previamente publicados . Se aplicó el análisis de hibridación con sonda de ADN y/o la secuenciación del ADN para la detección de Arg679, tal como se ha descrito. Se analizaron ciento cuarenta sujetos APCR-positivos y 31 sujetos APCR-negativos para todas las mutaciones. Nuestro grupo de sujetos de control sometidos a pruebas de mutaciones trombofílicas, 𝑛=31, se eligió aleatoriamente entre los 767 sujetos APCR negativos identificados como normales con la prueba APCR clásica de Coatest. Se identificó una media de 2,59 y una desviación estándar de 0,2804 para este grupo de 𝑛=767 sujetos APCR negativos. Por el contrario, se identificó una media de 1,745 y una desviación estándar de 0,1104 para el APCR positivo (heredado más adquirido) 𝑛=140. El valor mínimo identificado para el APCR negativo fue de 2,160 mientras que para el APCR positivo fue de 1,490. El valor máximo identificado para el APCR negativo fue de 3,030, mientras que para el APCR positivo fue de 2,060 segundos. Las mutaciones trombofílicas interfieren en el equilibrio de la coagulación variando el tiempo de aPTT relacionado con el rango de la relación APC.
Todas las mutaciones se analizaron por duplicado y se incluyeron controles positivos consistentes en ADN de individuos heterocigotos y homocigotos para las mutaciones FVL y MTHFR-C677T, y de individuos heterocigotos para otras mutaciones investigadas cuando se disponía de él. Se incluyó un control negativo, consistente en agua en lugar de plantilla de ADN, en cada ejecución de la PCR. La amplificación de la PCR se realizó en el GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer, EE.UU.).
2.6. Secuenciación del ADN para verificar las mutaciones identificadas
Secuenciación del ADN en el 50% de los productos de la PCR de los sujetos seleccionados para la mutación Arg679 para verificar el genotipo normal obtenido por el análisis de hibridación de sonda Southern blot-ADN para estos sujetos. Los productos de PCR de 400 pb del exón 13 que contiene el sitio Arg679 del gen FV se purificaron utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Ltd, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante y se enviaron para la secuenciación del ADN a un proveedor externo de servicios de secuenciación (MWG Biotech, Alemania). Una muestra positiva para la mutación de Cambridge mediante el análisis PCR/REA también se purificó utilizando el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen Ltd, Reino Unido) y se envió para su secuenciación para confirmar la mutación Arg306.
2.7. Los niveles de los factores V, VIII y IX
Se determinaron los niveles de los grupos APCR positivos y APCR negativos mediante un ensayo de APTT de una etapa en un coagulómetro MDA 180 (Organon Teknika, Cambridge, Reino Unido), utilizando plasma deficiente en factores V, VIII y IX (Diagnostica Stago). El grupo negativo de APCR estaba formado por 50 mujeres seleccionadas al azar de diferentes lotes de pruebas Coatest, que proporcionaron la base para el grupo de control en la comparación de datos entre diferentes variables.
Los resultados de los niveles de los factores V, VIII y IX se expresaron como niveles porcentuales (%), y los rangos de referencia utilizados son los que se utilizan actualmente en la clínica del Laboratorio de Hematología de la UCHG. Cada corrida fue controlada mediante el uso de un control normal (MDA verify 1, Biomerieux) y anormal (control de coagulación A, Technoclone GmbH).
2.8. Análisis estadístico de los resultados adversos del embarazo en el grupo observado en las 907 mujeres incluidas en el estudio
Los datos se recogieron del Departamento de Maternidad de la UCHG. El número y el tipo de resultados del embarazo estudiados se analizaron con el software SPSS versión 17.0. Se utilizó la prueba de Chi Cuadrado de Pearson para comparar el grupo APCR positivo y el grupo APCR negativo para analizar las mutaciones trombofílicas y la gama de resultados adversos asociados a cada grupo. Se utilizó la prueba de Chi-cuadrado de Pearson para comparar el número y el tipo de resultados adversos del embarazo en el grupo de APCR heredado frente al adquirido. Se utilizó el SPSS para analizar los niveles de los factores de coagulación V, VIII y IX mediante la prueba estadística de Kruskal-Wallis.
2.9. Criterios para el diagnóstico de resultados adversos
PET-BP (presión arterial) ≥140/90 mmHg, +1 proteinuria y edema. PIH-BP ≥140/90 sin proteinuria de acuerdo con la Revista Oficial de la Sociedad Internacional para el Estudio de la Hipertensión en el Embarazo. El RCIU se define como un crecimiento fetal inferior al 5º percentil para la edad gestacional . El BPN se define como un peso inferior a 2.500 g (hasta 2.499 g inclusive), independientemente de la edad gestacional.
3. Resultados
Identificamos el 15,4% (𝑛=140) de la cohorte de estudio (𝑛=907) como APCR positivo con pruebas de Coatest adquiridas y/o heredadas. Los niveles de los factores V, VIII y IX mostraron una correlación positiva con un fenotipo APCR adquirido. Los niveles de cada factor en los grupos APCR positivo (heredado) y APCR positivo (adquirido) y APCR negativo se muestran en la Tabla 2 y la Figura 1. Los niveles de los factores V, VIII y IX en el grupo APCR adquirido fueron significativamente mayores en comparación con el grupo de control normal. Las medias fueron factor V 131,5 UI/dL frente a 114,6 UI/dL en el grupo de control, factor VIII 128,7 UI/dL frente a 111,9 UI/dL en el grupo de control y factor IX 114,8 UI/dL frente a 106,9 UI/dL en el grupo de control.
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(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
(a) Gráfico que compara los niveles de FV en los distintos grupos del estudio, (b) gráfico que compara los niveles de FVIII en diferentes grupos dentro del estudio, y (c) gráfico que compara los niveles de F IX en diferentes grupos dentro del estudio.
Dos sujetos (66%) del grupo APCR positivo tenían mutaciones trombofílicas comunes, el 32% de los cuales tenía la mutación FVL. Se identificaron un total de 𝑛=116 mutaciones en este grupo, 68 sujetos tenían una mutación, 23 tenían dos mutaciones, 1 sujeto tenía tres mutaciones, y cuarenta y ocho sujetos no tenían ninguna de las mutaciones conocidas examinadas.
Dentro del APCR positivo adquirido (sin FVL) (𝑛=105), se distribuyeron 70 mutaciones entre 61 sujetos que tenían una o más de estas mutaciones. Dentro del grupo APCR negativo (𝑛=31), 18 sujetos tenían una mutación. La distribución de las mutaciones trombofílicas se resume en la Tabla 3.
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| (*1) 𝑛=140 son sujetos con APCR total (adquirida + modificada). (*2) 𝑛=105 son sujetos con APCR adquirida, sin FVL heredada. (*3) 𝑛=31 son sujetos con APCR negativo analizados de entre 767. 𝑛: Número de sujetos; ht: Heterocigotos; hom: Homocigotos; H: Haplotipo. Sujetos identificados con más de una mutación simultáneamente: en el grupo total de APCR, (heredada más adquirida) Tenían 13 sujetos con MTHFR+FVL; 1sujeto con MTHFR + FVL + Cambridge; 7 sujetos con MTHFR + HR2; 1 sujeto con protrombina G20210A + HR2; y 1 sujeto con protrombina G20210A + MTHFR; en el grupo APCR adquirido, tenían 7 sujetos con MTHFR+HR2; 1 sujeto con protrombina G20210A + HR2; 1 sujeto con protrombina G20210A + MTHFR. |
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Las frecuencias de los resultados adversos en los grupos APCR positivo y APCR negativo fueron muy similares, con un 35,7% y un 34,2%, respectivamente (Tabla 4). La comparación de los resultados adversos del embarazo y las mutaciones trombofílicas se resume en la Tabla 5. La HIP mostró una asociación estadísticamente significativa (𝑃<0,05) con Cambridge y protrombina G20210A. La LBW mostró una asociación estadísticamente significativa (𝑃<0,05) con HR2 y MTHFR.
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| NA: no se calculan estadísticas porque no hay RCIU en los grupos MTHFR y HR2. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discusión
Se ha informado que la frecuencia de APCR es de aproximadamente el 5% en la población caucásica general . Esto varía del 1% al 15% en diferentes países, con una frecuencia del 3% reportada en Italia y España y una frecuencia del 15% reportada en el norte de Suecia . Se ha informado de que la APCR en la población general y durante el embarazo está causada con mayor frecuencia por la mutación FVL , la APCR heredada.
Sin embargo, varios informes han demostrado que entre el 5 y el 10% de los APCR en caucásicos no implican el FVL, y se desconoce la causa de los APCR positivos en estos casos . En nuestra cohorte de estudio (𝑛=907), la frecuencia de APCR adquirida, determinada por el método clásico de la prueba Coatest, del 11,5%, fue sustancialmente mayor que la frecuencia de APCR heredada identificada por las pruebas Coatest modificadas, del 3,9%. De Visser et al. demostraron que una APCR alterada en ausencia de TVF confiere un riesgo 2,5 veces mayor de trombosis venosa .
En este estudio, se demostró una correlación estadística significativa del fenotipo APCR adquirido con los niveles de los Factores V, VIII y IX. Serían necesarios más estudios para determinar la interacción de los factores de coagulación para caracterizar mejor este fenotipo APCR adquirido en el embarazo temprano. El APCR adquirido puede ser el resultado de una compleja serie de reacciones que dan lugar a una degradación defectuosa de estos factores de coagulación mediada por la APC. A su vez, un aumento de estos factores de coagulación en etapas tempranas del embarazo podría causar un desequilibrio en la cascada de coagulación y conducir a un daño vascular y endotelial durante la implantación y la placentación. Esto tiene el potencial de causar infartos en la placenta y altos niveles de deposición de fibrina, lo que se ha asociado previamente con la APCR . El aborto espontáneo puede tener lugar en respuesta a un mayor desequilibrio de la coagulación, y si hay otros factores trombóticos, incluidas las mutaciones trombofílicas, que interactúan simultáneamente cuando el sujeto está más allá de la 20ª semana de embarazo, el daño podría convertirse en TEP o HIP.
Las mutaciones en el gen FV, excluyendo el FVL, particularmente en los otros sitios de escisión del FV, Arg306 y Arg679, tienen el potencial de contribuir al fenotipo APCR . El haplotipo (H) R2 también se ha asociado con una APCR leve cuando se encuentra en combinación con el FVL . Se han identificado otras mutaciones en el gen FV; sin embargo, sería necesario estudiar una población de embarazadas más amplia para determinar si estas mutaciones contribuyen significativamente a la APCR en las poblaciones caucásicas . La trombofilia durante el embarazo se ha relacionado con mutaciones distintas de las localizadas en el gen FV, como la protrombina G20210A y la MTHFR-C677T . En este estudio, identificamos mutaciones trombofílicas en el 66% de nuestro grupo APCR positivo (adquirido más heredado) (𝑛=140). Uno de esos sujetos tenía 2 mutaciones en el gen FV, FVL y FV Cambridge-G1091C, en dos sitios de escisión de FV para APC . En este estudio también se descubrió que este sujeto era portador de la mutación MTHFR-C677T. Estudios anteriores establecieron que la presencia de más de un polimorfismo protrombótico se asocia con un riesgo sustancial de TEV con un alto riesgo de resultados adversos del embarazo . Además, más recientemente la mutación MTHFR-C677T ha sido implicada en la preeclampsia. La alta frecuencia de MTHFR-C677T en los grupos APCR negativo y APCR positivo puede subyacer a las diferencias específicas de las poblaciones . Las discrepancias en los resultados adversos del embarazo asociados a la MTHFR-C677T pueden explicarse por las diferencias de frecuencia específicas entre las poblaciones.
También identificamos la protrombina G20210A en 3 sujetos del grupo APCR adquirido sin la presencia de la mutación FVL, con el haplotipo (H) HR2 y la MTHFR-C677T identificados en los grupos APCR positivo (adquirido más heredado) y APCR negativo.
Las muestras APCR negativas (𝑛=31) analizadas en busca de mutaciones trombofílicas en este estudio para representar la cohorte normal son un número de muestra pequeño, y esto puede ser un defecto de nuestro estudio que da lugar a diferencias no significativas. Si se hubiera analizado un mayor número de APCR negativos se habrían obtenido resultados más seguros. Esto puede ser algo a investigar en un futuro estudio.
Si bien algunos estudios anteriores han mostrado una asociación de APCR positivo con TEP, RCIU y DIU, en este estudio no hubo diferencias significativas en la frecuencia de resultados adversos entre los grupos de APCR positivo y APCR negativo. Esto parece ser coherente con otros estudios anteriores. No obstante, la frecuencia global de resultados adversos del embarazo en el APCR positivo hace de este grupo de estudio «un grupo de alto riesgo». No se incluyeron factores ambientales como el tabaquismo y el índice de masa corporal (IMC) que podrían haber influido en la tasa de APCR adquirida y en la frecuencia de los resultados adversos identificados. Esta es una limitación del estudio.
En el total de nuestro grupo de estudio, las mutaciones trombofílicas, incluyendo la FVL Cambridge y la protrombina G20210A, parecen estar relacionadas con la HIP, mientras que la MTHFR-C677T y el haplotipo HR2 parecen estar asociados con la LBW. Aunque el APCR positivo por sí mismo no parece ser la causa de resultados adversos graves durante el embarazo, el APCR heredado puede, sin embargo, tener un efecto sobre la hipertensión cuando está presente en combinación con otros factores de riesgo trombofílicos conocidos y desconocidos que actúan simultáneamente durante el embarazo.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Irish Health Research Board. Los autores agradecen a las mujeres embarazadas que consintieron en participar en el estudio y a las matronas de la sala de partos del UCHG. Los autores desean agradecer a Benoit Houeix su aportación al análisis estadístico incluido en este trabajo y también a la Dra. D. Mongan, UCH, Galway, por su colaboración al proporcionar la información sobre los resultados adversos y el análisis de los datos de los sujetos incluidos en el estudio.