Síntesis asimétrica de la batracotoxina: Las toxinas enantioméricas muestran divergencia funcional contra el NaV

Los efectos fenotípicos de los venenos agudos que se encuentran entre la rica farmacopea de la vida terrestre y marina se han documentado desde la antigüedad. El aislamiento y la caracterización de los compuestos tóxicos han permitido disponer de importantes reactivos químicos para el estudio de complejos circuitos bioquímicos (1). Los estudios de este tipo han revelado un gran número de agentes peptídicos y de moléculas pequeñas que se dirigen a los canales iónicos de sodio activados por voltaje (NaV), una clase obligatoria de proteínas de membrana para la señalización bioeléctrica (1-4). Entre la colección de moduladores del NaV conocidos se encuentran tres agentes estructuralmente relacionados, la (-)-batracotoxina , la veratridina y la aconitina (Fig. 1A) -derivados amínicos lipofílicos de gran tamaño que se cree que comparten un locus de unión común en la región del poro interno del NaV (3) (sitio 2, Fig. 1B). Sin embargo, la influencia de estas toxinas en la apertura de iones difiere claramente. Por un lado, (-)-BTX, el principal constituyente tóxico de las ranas venenosas colombianas (género Phyllobates), es un agonista completo del NaV, haciendo que el canal se abra más fácilmente a potenciales de membrana hiperpolarizados y bloqueando la inactivación rápida (entre otros efectos característicos) (3-5). Por el contrario, las actividades de la veratridina y la aconitina se describen mejor como agonismo parcial e inhibición de la función del canal, respectivamente (5). A pesar de los recientes conocimientos de la biología estructural sobre la arquitectura tridimensional de los NaV procarióticos (6-9), se carece de una comprensión molecular de la influencia de las toxinas del sitio 2 sobre la conducción de iones y la cinética de la puerta de iones. Los estudios de estructura-actividad de las toxinas, en combinación con los experimentos de mutagénesis de proteínas, pueden abordar cuestiones relacionadas con la naturaleza dinámica de la función del canal y pueden guiar el diseño racional de moduladores de moléculas pequeñas de la actividad del NaV (1). La potencia de la (-)-BTX (10), su historia como sonda arquetípica del sitio 2 de moléculas pequeñas (4) y sus efectos incomparables sobre la activación del canal la convierten en un compuesto «líder» óptimo para tales investigaciones.

(-)-BTX uniéndose a los NaVs altera todos los aspectos de la función del canal, resultando en un cambio hiperpolarizado en la dependencia del voltaje de la activación, la inhibición de la inactivación rápida y lenta, una disminución de la conductancia del canal único, y la reducción de la selectividad de iones (3, 4). La utilidad de este producto natural como activador del NaV ha conducido a un agotamiento sustancial del suministro mundial, que en su día superaba 1 g pero que en 2009 era inferior a 170 mg (11, 12). Desde que la toxina fue aislada por primera vez en 1963 por Märki y Witkop a partir de ranas venenosas recolectadas en la selva tropical del norte de Colombia (13), Phyllobates ha sido incluida en la lista de especies en peligro de extinción, por lo que la recolección de (-)-BTX natural de esta fuente está restringida. (-)-BTX también se ha identificado en especies selectas de aves (género Pitohui e Ifrita) (14) y escarabajos (género Choresine) (15), pero sólo en pequeñas cantidades (por ejemplo, ~1,8 μg de (-)-BTX por escarabajo). Aunque se han divulgado síntesis semi (16) y racémicas (17) de BTX-A (Fig. 1C), un compuesto que carece del éster de pirrol C-20, la longitud de cada uno de estos trabajos (>45 pasos lineales) impide la producción fácil de (-)-BTX o análogos selectos. En consecuencia, nuestro deseo de utilizar BTX y formas modificadas de la misma para examinar la dinámica de los canales y los mecanismos de apertura de iones ha motivado nuestros esfuerzos para obtener el producto natural a través de la síntesis de novo.

El análisis retrosintético de (-)-BTX nos llevó a esbozar un plan que permitiera el ensamblaje en la última etapa del anillo E de homomorfolina y la elaboración del éster alílico C-20 (Fig. 1C), facilitando así el acceso a formas modificadas de la toxina. Estudios previos de relación estructura-actividad utilizando un pequeño número de derivados semisintéticos de BTX (10, 18) y análogos del anillo C/D/E de BTX (19) revelaron la importancia del éster C-20, la amina terciaria y el esqueleto tetracíclico para la actividad agonista del NaV. El desentrañamiento del BTX-A expone un armazón similar al esteroide 1, cuyo ensamblaje está confundido por dos grupos angulares en la unión C/D-anillo, el exo-metileno C-11 y el alqueno C-8/C-9. Para maximizar la convergencia en nuestro plan sintético, concebimos una estrategia de desconexión de 1 a través del anillo C. Esta idea reduciría el problema de la construcción de 1 en dos fragmentos, uno que expresara el sistema del anillo A/B (3, 20) y un segundo que comprendiera el ciclopentano del anillo D (4, 21). La ejecución exitosa de este esquema podría producir la toxina deseada a través de una secuencia de pasos lineales que no suman más de 20 a 25.

Nuestra síntesis de (-)-BTX comenzó con el acoplamiento de la metilenciclopentanona 4 (21) (fig. S1A) y el bromuro de vinilo 3, al que se accedió a partir de la (S)-(+)-cetona de Hajos-Parrish a través de una secuencia modificada de pasos originalmente esbozada por Parsons y colaboradores (20) (fig. S1B). La unión de los fragmentos 3 y 4 para generar el triciclo A/B/D enlazado 5 supuso el primero de una serie de retos en el desarrollo del proceso. Un intento inicial de realizar esta transformación implicó el intercambio de Li-Br de 3 con n-BuLi (Bu, butilo) y la adición secuencial de la enona 4. Aunque se obtuvo 5 en estas condiciones, el rendimiento del producto nunca superó el 30%. Los experimentos de apagado de deuterio con D2O validaron nuestra hipótesis de que la α-deprotonación de 4 era competitiva con la vía de adición de cetona deseada. Se examinaron reacciones de transmetalación de las especies de vinil-litio con ZnCl2, ZnBr2, MgBr2-OEt2 (Et, etilo), CeCl3, Yb(OTf)3 (Tf, trifluorometansulfonato), CeCl3-2LiCl y LaCl3-2LiCl, pero ninguna de estas medidas resultó eficaz (22, 23). La adición de un equivalente de LiBr anhidro al medio de reacción de 3 mejoró la eficacia del acoplamiento en >20% (24). Siguiendo esta pista, un protocolo optimizado utilizando 2,1 equivalentes de t-BuLi, que presumiblemente genera un equivalente de LiBr in situ, permitió obtener 5 de forma reproducible como un único diastereómero en un rendimiento del 65% a escala multigramo. La facilidad de síntesis de este material y de su forma desilada 6 permitió los esfuerzos posteriores para identificar las condiciones para la anulación en tándem del anillo C y la instalación del centro cuaternario C-13.

Una evaluación de los métodos disponibles para el cierre del anillo de los 1,6-eninos nos llevó a considerar procesos iniciados por radicales (25). Bajo tales condiciones, un radical C-13 3° incipiente podría ser interceptado para forjar la unidad de aminometileno angular (o un sustituto adecuado). Sin embargo, los esfuerzos por examinar primero la formación del anillo C en 6 revelaron la falacia potencial de este plan. El uso de n-Bu3SnH y trietilborano (Et3B) para promover el evento de ciclización dio lugar a la generación de dos isómeros, 7 y 8, en una proporción 1:5 que favorece al producto no deseado (Fig. 2A). Los estudios de Stork y Beckwith y colaboradores han demostrado que la concentración de sustrato y la temperatura de reacción pueden influir en el modo de ciclización (es decir, 5-exo-trig frente a 6-endo-trig) en las reacciones de enyne mediadas por radicales (26, 27). A una temperatura elevada (130°C) y con una dilución quíntuple de 6, se observó una inversión de la selectividad, obteniéndose un ligero exceso del tetracíclo deseado (relación 1,3:1 de 7 a 8; Fig. 2A). El rendimiento del producto combinado de esta transformación superó el 90%, lo que anima a seguir explorando esta química, a pesar de los modestos resultados de selectividad.

Los repetidos intentos de capturar el radical intermedio C-13 con derivados de oxima e hidrazona generados a partir de formaldehído no dieron lugar al producto de aminometilación esperado (28). Obligados a considerar soluciones alternativas, reconocimos que un grupo de éter de sililo modificado añadido desde el alcohol C-14 vecino estaría bien posicionado para interceptar el radical 3° (29). Basándonos en los precedentes disponibles, se seleccionó un cloruro de alquinosililo, Me3SiC≡CSiEt2Cl (Me, metilo), para modificar el alcohol C-14 de 6 (30, Fig. 2A). El tratamiento del siléter resultante (9) con n-Bu3SnH y Et3B a 150°C dio lugar a una cascada de ciclación para dar el pentaciclo 10 como producto exclusivo (31). Dentro de los límites de la detección por resonancia magnética nuclear de protones (1H NMR), en este proceso no se generó ningún isómero de anillo C de cinco miembros correspondiente. Nuestros esfuerzos preliminares para entender el papel de los grupos sustituyentes C-14 en la selectividad de la reacción sugieren que la protección silílica del alcohol (junto con las elevadas temperaturas de reacción) favorece el cierre del anillo 6-endo-trig. Aunque se necesitan estudios adicionales para apreciar estos datos de selectividad estructural, nuestra cascada de ciclización de enyne ofrece un enfoque convergente para sintetizar andamios de esteroides sustituidos y debería facilitar el acceso a una amplia gama de tales compuestos.

Una inspección minuciosa de los productos de ciclización radical derivados de 6 o 9 reveló un resultado inesperado relacionado con la estructura de la fracción de organoestano resultante (Fig. 2, A y B). La carboestanilación del grupo alquino debería dar lugar a un producto de vinilo-estaño, como se observó en la reacción de 6. Inesperadamente, cuando 9 se sometió a las condiciones de reacción, el alilestano 10 fue el único producto, un resultado confirmado tanto por RMN como por cristalografía de rayos X. La formación del alilstanano 10 puede racionalizarse a través de un mecanismo que implica la transferencia de átomos de 1,4-H de un radical vinilo intermedio (32) (Fig. 2B), una propuesta apoyada por un experimento de etiquetado con deuterio (fig. S5). Aunque este resultado no estaba previsto, la eficiencia y selectividad de la reacción de ciclación nos obligó a avanzar en este material. De cara al futuro, la versatilidad del grupo alilestano debería servir para futuros esfuerzos de preparación de BTXs modificados por el anillo C.

La disponibilidad de 10 en nueve pasos a partir de la cetona Hajos-Parrish permitió la producción de cantidades sustanciales de material para completar la síntesis objetivo. La escisión del éter silílico puente en 10 se llevó a cabo con un exceso de n-Bu4NF, revelando un intermedio diol que posteriormente se convirtió en 11 mediante la oxidación del alcohol mediada por el ácido 2-yodoxibenzoico y la escisión quimioselectiva del vinilsilano (57%; Fig. 2B). La conversión del aldehído 11 en cloroacetamida 12 se realizó siguiendo una secuencia de tres pasos en un solo frasco (16, 33). A partir de 12, el cierre eficiente del anillo de homomorfolinamida con NaOEt (92%) (17) proporcionó un intermedio versátil para la modificación de las unidades del anillo C y D. Esto último pudo lograrse mediante el triflato de enol del anillo D, preparado con KN(SiMe3)2 y PhNTf2.

La introducción del alcohol C-11α del alilestano del anillo C 13 presentó uno de los retos más difíciles en nuestra aproximación al BTX (Fig. 2B). Aunque la protodestanilación de 13 para generar el correspondiente C-11 exo-metilen-ciclohexano tuvo un éxito limitado (34), todos los intentos posteriores de oxidar este compuesto a la cetona 15 (es decir, O3, OsO4 y RuO4) no dieron producto. Inspirados por un informe de Kim y Fuchs, intentamos convertir 13 en el correspondiente cloruro de alilo utilizando CuCl2 (35). Fortuitamente, al llevar a cabo esta reacción en dioxano en condiciones aeróbicas se obtuvo el enal 14 en un 85% de rendimiento con sólo una cantidad menor del producto clorado (~10%). Aunque los detalles mecánicos de esta transformación siguen sin estar claros, sólo conocemos otro ejemplo documentado de una reacción de oxidación de este tipo, que utiliza un catalizador de vanadio y O2 (36). El enal 14 está adecuadamente dispuesto para su conversión en la cetona C-11 15 siguiendo una serie de pasos de interconversión de grupos funcionales destacados por un reordenamiento de Curtius (37). La ausencia de un cromóforo viable en la batracotoxina A (BTX-A) dificulta la purificación de este material; en consecuencia, en la secuencia que conduce a 15, el metoxiacetal C-3 se intercambió con alcohol p-metoxifenílico.

La terminación del esqueleto de carbono de (-)-BTX se llevó a cabo mediante un acoplamiento cruzado catalizado por paladio de tributilo(1-etoxivinilo)estaño a triflato de vinilo 15 (Fig. 3A) (38). La hidrólisis in situ del éter de enol incipiente con ácido oxálico 1 M proporcionó la enona 16 (77%). Tras una amplia selección de agentes reductores, se logró una reducción global estereoselectiva de la enona 16 con un rendimiento del 33% mediante el tratamiento con AlH3 recién preparado (39). Nuestra hipótesis es que la lactama básica de Lewis (o una forma reducida) actúa como un elemento estereocontrolador fundamental, ya que el tratamiento de la enona 15 con agentes reductores de hidruro alternativos produjo exclusivamente el alcohol C-11β no deseado. El uso de AlH3 también favoreció la generación del epímero de alcohol alílico C-20 correcto, un resultado esteroquímico que puede racionalizarse mediante un modelo que invoca el control de la quelación (38). La desprotección del producto de la reducción de AlH3 en condiciones ácidas permitió obtener (-)-BTX-A en un 83% de rendimiento (17). Finalmente, empleando una modificación del protocolo de acilación de (-)-BTX-A de Tokuyama, Daly y Witkop con el anhídrido mixto preparado a partir de cloroformato de etilo y ácido 2,4-dimetilpirrol-3-carboxílico (10), se completó la síntesis de 2 mg de (-)-BTX (79%, 0,25% de rendimiento global) en 24 pasos a partir de (S)-(+)-cetona de Hajos-Parish. El producto era idéntico en todos los aspectos a una muestra del material natural y a los datos espectroscópicos registrados anteriormente (40, 41). Nuestro plan sintético también permitió la preparación a escala de miligramos del antípoda de la toxina no natural, (+)-BTX, el conocido éster de benzoato de (-)-BTX-A (BTX-B; Fig. 3B) (42, 43), y el enantiómero de este compuesto (ent-BTX-B).

La caracterización electrofisiológica del (-)-BTX sintético y del BTX-B frente al NaV1.4 de rata (rNaV1.4) confirmó que este último también funciona como agonista y tiene una potencia similar a la del producto natural (fig. S6 y tabla S12). Informes anteriores y nuestros propios estudios indican que el grupo éster de BTX-B es más estable que el acilpirrol sensible a la oxidación de BTX; por lo tanto, se realizaron experimentos adicionales con el primer compuesto (42, 43). El BTX-B sintético se probó contra un subconjunto de isoformas representativas del NaV, incluyendo el rNaV1.4, el NaV1.5 humano y el NaV1.7 humano. La aplicación de 10 μM de BTX-B a células de ovario de hámster chino que expresaban un único subtipo de NaV dio lugar a una corriente de sodio sostenida en todos los casos (Fig. 4A y figs. S7 y S8). El agonismo dependiente del uso de las isoformas de NaV por BTX-B impidió la inactivación en estado estacionario de >80% de la población de canales de sodio (Fig. 4A y fig. S8). El BTX-B también indujo un desplazamiento hiperpolarizante característico (-44.9 a -51.5 mV) en el voltaje medio máximo (V0.5) de activación de las isoformas de NaV de tipo salvaje (Fig. 4B y tabla S13). La similitud de estos datos es consistente con la alta conservación de la secuencia de la proteína entre los subtipos de NaV en las hélices S6 que recubren el poro interno y que forman el sitio putativo de unión a la toxina (fig. S9).

Siguiendo trabajos anteriores de nuestro laboratorio (19) y otros (44, 45), nos preguntamos si la forma enantiomérica de BTX se uniría con alta afinidad al NaV con efectos funcionales análogos. Esta pregunta sólo puede ser respondida con la disponibilidad de una síntesis de novo de la toxina. En consecuencia, se realizaron grabaciones electrofisiológicas con ent-BTX-B contra rNaV1.4. Estos datos revelaron que el ent-BTX-B es un antagonista del canal dependiente del uso y del estado, con una concentración inhibitoria semimáxima medida de 5,3 ± 0,6 μM . La concentración para la inhibición medio-máxima del NaV por ent-BTX-B es similar en magnitud a la concentración medio-máxima efectiva para el agonismo de BTX-B (1.0 ± 0.1 μM; fig. S10) medido bajo condiciones idénticas. En particular, a diferencia del antípoda natural, la unión de ent-BTX-B sólo causó un cambio mínimo en la V0.5 de activación y la V0.5 de inactivación en estado estacionario (tabla S14). Además, el bloqueo del canal fue totalmente reversible por este inhibidor.

Para determinar si BTX-B y ent-BTX-B comparten un sitio de unión superpuesto dentro de la región del poro interno del NaV, se probó ent-BTX-B contra cinco mutantes de punto único de rNaV1.4 que han demostrado previamente desestabilizar la unión de BTX (Fig. 4, E y F, y fig. S12) (19). La mutación de N434 (46), L1280 (47), F1579 (48) y N1584 (48) a lisina resultó en una disminución de ~3 a 30 veces en el bloqueo de la corriente por 5 μM ent-BTX-B. Sin embargo, frente a F1236K (49), ent-BTX-B mantuvo una actividad significativa (33,6 ± 2,1% de inhibición de la corriente). La evidente diferencia entre ent-BTX-B y BTX-B indica una región de unión superpuesta, pero no idéntica, dentro de la cavidad interna del poro. Parece que el canal abierto es lo suficientemente grande como para acomodar ligandos de aminas terciarias lipofílicas (19, 45, 50). Alteraciones sutiles en la postura de unión de estos ligandos parecen alterar drásticamente la respuesta funcional de la proteína. Las investigaciones futuras se dirigirán a delinear las interacciones precisas entre el canal y la toxina que distinguen la activación de la inhibición por los derivados de BTX y las toxinas lipofílicas relacionadas.