12 de mayo de 2018
Una pregunta común que los científicos siempre hacen cuando obtienen la señal de un ensayo basado en anticuerpos es: «¿Representa esta señal realmente la presencia y la cantidad de mi proteína?»
La especificidad de los anticuerpos es siempre una preocupación para los científicos. Aunque hay una serie de métodos de validación que se han utilizado para las pruebas de especificidad, los datos a menudo se sobreinterpretan. Los datos de las investigaciones de varios grupos han demostrado que algunos de los anticuerpos monoclonales más utilizados en el mercado no son realmente monoespecíficos. Y la reactividad cruzada puede inducir a error a los investigadores con resultados falsos positivos, y potencialmente causar efectos secundarios inesperados e informes de diagnóstico falsos para los médicos.
¿Cuáles son los controles que debemos utilizar para la validación de la especificidad de los anticuerpos?
Las líneas celulares y los tejidos que expresan las proteínas diana en cantidades elevadas pueden utilizarse como controles positivos para la validación de los anticuerpos, y pueden ser proteínas endógenas o proteínas sobreexpresadas codificadas por un clon de ADNc. Sin embargo, el control positivo no podrá confirmar la especificidad del anticuerpo. Se puede ver una banda del tamaño correcto o una tinción positiva en la localización subcelular correcta, pero todas ellas podrían ser señales falsas positivas de la reactividad cruzada del anticuerpo. Así que normalmente para la validación de anticuerpos, se requiere un control negativo para la evaluación de la unión no específica.
La validación por knockout es hasta ahora el mejor control negativo para la evaluación de la especificidad del anticuerpo. En la validación knockout, el anticuerpo se prueba en una línea celular knockout que no expresa la proteína diana. A partir de 2017, OriGene se ha asociado con EdiGene, un innovador de CRISPR, para producir células de doble knockout de una manera de alto rendimiento. A diferencia de la línea celular knockout de Horizon, las líneas celulares knockout de OriGene proceden de líneas celulares de uso común, como HEK293T o HeLa, lo que hace que el producto sea más relevante para los investigadores.En esta línea celular de doble knockout, la diana del anticuerpo no está presente ya que el gen que codifica la proteína se elimina o «knock out». Las muestras de las células knockout y de las células parentales (de tipo salvaje) se analizan una al lado de la otra contra el mismo anticuerpo, y si el anticuerpo es realmente específico, sólo debería detectar la señal específica en la célula de tipo salvaje pero no en la línea celular knockout. Utilizando los lisados de estas células knockout, hemos validado más de 100 anticuerpos monoclonales (anticuerpos validados KO). Se cree que la validación knockout ofrece un verdadero control negativo para la prueba de especificidad de los anticuerpos.
¿Pero la validación knockout es suficiente para confirmar la monoespecificidad de un anticuerpo? En primer lugar, los efectos fuera de la diana de las células knockout no están bien estudiados en este momento. En primer lugar, los efectos fuera de la diana de las células knockout no están bien estudiados en este momento, por lo que es posible que una célula knockout no sólo elimine la expresión de la proteína de interés, sino que también elimine o reduzca la expresión de otra proteína, que puede ser una proteína que reaccione de forma cruzada con el anticuerpo. Por lo tanto, la señal negativa no siempre significa que el anticuerpo no reaccione con otras proteínas, excepto con la proteína de interés. En segundo lugar, las pruebas con células/tejidos knockout sólo son posibles para las proteínas no esenciales. Para las proteínas esenciales, el knockout es imposible. Por lo tanto, para estas proteínas, necesitará otra forma de probar la especificidad del anticuerpo.
Hace varios años, OriGene desarrolló un método de matriz de proteínas para probar la especificidad de los anticuerpos. Con la mayor colección del mundo de lisados de sobreexpresión, hemos creado un chip de proteínas único que contiene >10k proteínas humanas sobreexpresadas por duplicado en un único portaobjetos de vidrio recubierto de nitrocelulosa. Esta tecnología de microarray de proteínas se ha utilizado para validar la especificidad de muchos anticuerpos monoclonales OriGeneUltraMAB™. Al aumentar el número de proteínas en el chip, la reactividad cruzada de un anticuerpo puede estudiarse más a fondo en todo el proteasoma humano.
En resumen, las pruebas de especificidad de los anticuerpos son bastante complicadas. Necesita ser validado a través de múltiples herramientas y direcciones.A medida que la tecnología siga avanzando, tendremos más activos valiosos y procedimientos estandarizados para la validación de anticuerpos.Los científicos no se enfrentarán a la misma pregunta cuando obtengan señales positivas de sus ensayos basados en anticuerpos.