eläimet
S. purpuratus -lajeja pidettiin keinotekoisessa 14 °C:n lämpötilassa olevassa merivedessä. L. anatina kerättiin kesäkuussa 2016 Xiangshanin kosteikolta, Xiangshanin piirikunnasta, Hsinchun kaupungista, Taiwanista (GPS-koordinaatit 24.770779, 120.910742 E), kuljetettiin laboratorioon jäällä ja leikattiin välittömästi.
Konstruktiot ja plasmidit
SpAIDL:ien ja LaAIDL:ien entsymaattisen aktiivisuuden määrittämiseksi luotiin vastaavat bakteeri-ekspressiovektorit pASK-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9, LaAIDL1, 2 ja HsAID. Kunkin SpAIDL:n avoimet lukukehykset monistettiin genomisesta DNA:sta PCR:llä käyttäen Phusion-polymeraasia ja SpeI- ja XhoI-restriktiokohtia sisältäviä alukkeita (lisätaulukko 1). PCR-tuotteet pilkottiin SpeI:llä ja XhoI:lla (New England Biolabs) ja lisättiin TadA:n avoimen lukukehyksen korvaaviin NheI/XhoI-kohtiin pASK-TadA:ssa (lahjoitus tohtori Nina Papavasilioulta, Rockefeller University, New York). SpAIDL9:n osalta tämä kloonausstrategia muutti kolmannen aminohapon fenyylialaniinista seriiniksi, ja tämä F3S-mutaatio palautettiin takaisin F3:ksi käyttämällä Quikchange-mutagene-mutaatiokittiä (Stratagene) ja alukkeita SPA9S3FT/SPA9S3FB (lisätaulukko 1). HsAID monistettiin plasmidista, joka sisälsi ihmisen täyspitkän AID:n (pCDF-AID, lahja tohtori Nina Papavasiliou, Rockefeller University, New York). Kloonausstrategiassa toinen aminohappo muutettiin aspartaatista alaniiniksi, ja D2A palautettiin takaisin D2:ksi käyttäen Quikchange-mutagene-mutaatiokittiä (Stratagene) ja alukkeita hAIDA2DT/hAIDA2DB (lisätaulukko 1). Tyhjä pASK tuotettiin sulattamalla pASK-TadA:ta NheI/XhoI:lla, täyttämällä ylityskohdat Klenow-polymeraasilla ja ligoimalla T4-DNA-ligaasilla (Thermo Scientific). Kunkin LaAIDL:n avoimet lukukehykset monistettiin L. anatina cDNA:sta ja kloonattiin pJET1.2/blunt-kloonausvektoriin (Thermo Scientific). LaAIDLX:n avoimet lukukehykset leikattiin SpeI:llä ja XhoI:lla (New England Biolabs) ja kloonattiin pASK_V5-SpAID4a:n (kuvattu jäljempänä) XbaI/XhoI-kohtiin SpAID4a-insertin tilalle. On huomattava, että kloonatut fragmentit sisältävät alkuperäiset stop-koodonit 3′-päissään siten, että ilmentyvä proteiini ei sisällä V5-tagia.
Ekspressiokonstruktiot SpAIDL1:n ja LaAIDL1:n aktiivisen alueen mutantteja varten (SpAIDL1 H86R E88Q, SpAIDL1 H86R E88Q C123A C126A, ja LaAIDL1 H81R E83Q H298R E300Q) tuotettiin paikkaohjatulla mutageneesillä vastaavista villityyppisistä (tai yksittäisistä mutanteista) plasmideista käyttäen joko Quikchange-mutageneesisarjaa (SPA1H85RE87QT/SPA1H85RE87QB SpAIDL1 RQ:lle), tai perinteisellä PCR:llä käyttäen 5′-fosforyloituja alukkeita (SPA1CCAA-P/SPA1CCAAB SpAIDL1 RQAA:n toista muutossarjaa varten ja LaA1H81RE83QB/LaA1H81RE83Q-P ja LaA1H298RE300QB/LaA1H298RE300Q-P SpLaAIDL1 RQRQ:ta varten), minkä jälkeen tehtiin DpnI-digestio, ligatoitiin, jotta saatiin aikaan sirkularisoitua tuotteet, ja muunnettiin kompetenttiin E. A. RQRQ:aan. coli.
Rekombinanttiproteiinin ilmentymistason seuraamiseksi E. coli -bakteerissa luotiin bakteerien ilmentymiskonstruktiot pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX/HsAID. pASK_V5 luotiin anneenaamalla V5-tag-sekvenssin sisältävät oligonukleotidit pASK_V5F/pASK_V5R (lisätaulukko 1) ja ligoimalla ne pASK-TadA:n NheI/SalI-kohtiin. pASK-SpAIDLX/LaAIDLX-plasmideja käytettiin malleina vastaavien cDNA:iden monistamiseen ilman stop-kodonia käyttäen Phusion-polymeraasia ja lisätaulukossa 1 lueteltuja alukkeita, ja ne kloonattiin pASK_V5:n NheI/XhoI-kohtiin (SpAIDLX- ja HsAID-fragmenttien osalta) tai XbaI/XhoI-kohtiin (LaAIDLX-fragmenttien osalta). HsAID monistettiin pASK-hAID:sta. Molempien, SpAIDL9:n ja HsAID:n, sekvenssit muuttuivat jälleen tällä kloonausstrategialla, ja ne muutettiin takaisin oikeiksi sekvensseiksi edellä kuvatulla tavalla.
Genomisen DNA:n valmistelu
Kummankin, sekä S. purpuratusin että L. anatinan, genominen DNA puhdistettiin gDNA Spin Kit Tissue (Bioman) -laitteella valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna noin 1 × 106 S. purpuratus coelomosyyttiä ja 100 mg L. anatina -kudosta lisättiin erillisiin mikrosentrifugiputkiin, homogenisoitiin 200 µl:ssa puskuria GT (Bioman), joka sisälsi 200 mg proteinaasi K:ta, ja inkuboitiin 30 minuuttia 60 °C:n lämpötilassa solujen täydellisen lyysaamisen varmistamiseksi. Kun 200 µl BG-puskuria (Bioman) oli lisätty, näytteitä vorteksoitiin ja inkuboitiin 20 minuuttia 70 °C:ssa. Tämän jälkeen lisättiin 200 µl etanolia ja koko näyte ladattiin GD-spin-kolonniin (Bioman). Pesut 400 µl:lla WI-puskuria (Bioman) ja 600 µl:lla pesupuskuria suoritettiin sentrifugoimalla 10 000 × g:n nopeudella 30 s. Tämän jälkeen genomiset DNA:t eluoitiin 100 µl:lla eluointipuskuria (10 mM Tris pH = 8,0), joka oli esilämmitetty 60 °C:een.
RNA:n valmistaminen ja cDNA-synteesi
S. purpuratusin kelaneste vedettiin ruiskulla periostomakalvon läpi ja sekoitettiin välittömästi yhtä suureen tilavuuteen CMSFW-EI:tä (0,53 M NaCl, 10 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 11 mM Na2SO4, 30 mM EDTA, 50 mM imidatsoli). Kelomosyytit lingottiin ja resuspendoitiin 800 μl:aan EasyPure Total RNA -reagenssiin (Bioman). S. purpuratus -lajin ruokatorvi, ohutsuoli, paksusuoli ja sukurauhaset sekä L. anatina -lajin jalka, ruoansulatuskanava, sukurauhaset ja suolisto leikattiin yksittäisistä eläimistä. Pienet palat S. purpuratus- ja L. anatina -eläinten kiinteitä kudoksia lisättiin 200 μl:aan EasyPure Total RNA -reagenssia (Bioman), ja näytteet homogenisoitiin Bullet Blender -laitteessa (Next Advance) käyttäen 0,5 mm:n ZrO-helmiä. Liukenemattomat jäännökset lingottiin ja supernatantit siirrettiin tuoreisiin putkiin, jotka sisälsivät 600 μl EasyPure Total RNA Reagent (Bioman) ja 200 μg glykogeeniä kantaja-aineena. Kokonais-RNA puhdistettiin sitten valmistajan protokollan mukaisesti. Jäljelle jääneen gDNA:n ja muiden epäpuhtauksien poistamiseksi S. purpuratus RNA:ta käsiteltiin edelleen joko Turbo DNA-free kitillä (Ambion) tai RNeasy mini kitillä (Qiagen). Turbo DNA-free -kittiä (Ambion) käytettiin valmistajan protokollan mukaisesti, paitsi että DNaasi-digestiota varten lisättiin ylimääräistä MgCl2:ta (2,5 mM) ja CaCl2:ta (1 mM). RNeasy mini -kittiä (Qiagen) käytettiin valmistajan protokollan mukaisesti.
Noin 250-500 ng S. purpuratus- ja L. anatina RNA:ta kustakin kudoksesta muunnettiin cDNA:ksi ThermoScript RT-PCR Systemillä (Invitrogen) tai ToolsQuant II Fast RT Kitillä (Biotools). Molemmissa tapauksissa käytettiin satunnaisheksamereja ja noudatettiin valmistajan ohjeita.
KDNA:n päiden nopea monistaminen
SpAIDL9-transkriptien 5′- ja 3′-päät monistettiin käyttämällä SMARTer RACE -kittiä (Clontech) ja geenispesifisiä alukkeita SPA9CR1, SPA9CR2, SPA9CF1, SPA9CF2 (ks. lisätaulukko 2) valmistajan ohjeiden mukaisesti. PCR-tuotteet, jotka sisälsivät transkriptien 5′- ja 3′-päät, kloonattiin pJET1.2/blunt-kloonausvektoriin (Thermo Scientific), ja yksittäiset kloonit sekvensoitiin kokonaan.
Sequence analysis of the SpAIDL genes
Genominen DNA kolmesta S. purpuratus -yksilöistä (Sp105, Sp111, Sp112) käytettiin templaatteina SpAIDL1, 2, 3, 4a, 9:n avoimien lukukehysten monistamiseen käyttäen Phusion-polymeraasia ja lisätaulukossa 2 lueteltuja alukkeita. PCR-tuotteet kloonattiin pJET1.2/blunt-kloonausvektoriin (Thermo Scientific). Plasmidit puhdistettiin Tools mini plasmid kitillä (Biotools) ja toimitettiin kaupalliselle palvelulle (Genomics Taiwan) sekvensointia varten käyttäen joko pJET1.2:n eteenpäin suuntautuvia tai pJET1.2:n käänteisiä alukkeita.
Kustakin geenistä kerättiin vähintään kahdeksan sekvenssiä kustakin merisiilistä, ja alukesekvenssit jätettiin pois ennen sekvenssikohdistuksia. Kunkin geenin nukleotidisekvenssit linjattiin ensin kunkin S. purpuratus -geenin sisällä CLUSTALW-ohjelmalla (www.genome.jp/tools/clustalw), ja sen jälkeen valittiin kahta alleelia vastaavat dominoivat sekvenssit yksittäisten merisiilien välistä myöhempää vertailua varten. Kukin qPCR-reaktio (10 μl) sisälsi 5 μl Fast SYBR Green Master Mix -seosta (Applied Biosystems), alukkeita (0,1 μM) (ks. lisätaulukko 3) ja 1 μl templaattia, ja jokaiselle näytteelle asetettiin kaksi teknistä toistoa. qPCR-reaktiot suoritettiin 7500 Fast Real-Time PCR System -laitteessa (Applied Biosystems) siten, että aluksi denaturoitiin 95 °C:ssa 20 sekunnin ajan, minkä jälkeen tehtiin 40 sykliä, joissa 3 sekuntia 95 °C:ssa ja 30 sekuntia 60 °C:ssa. Geenien ilmentymistasojen määrittämiseen käytettiin standardikäyriä, ja normalisointiin käytettiin housekeeping-geenejä (Sp18S S. purpuratusille ja LaRPL39 L. anatinalle).
Bakteeri-infektiomalli
Vibrio diazotrophicus -bakteereja kasvatettiin nestemäisissä Difco marine broth -liemiviljelmissä (Difco marine broth, Becton Dickinson) 30 °C:n lämpötilassa 30 °C:n lämpötilan ollessa ja nopeuden ollessa 250 1/min. yli yön. Kuusi tervettä merisiiliä valittiin satunnaisesti ja jaettiin kahteen ryhmään, koeryhmään ja kontrolliryhmään. Kustakin eläimestä otettiin 0,5 ml kelanestettä klo t = 0. Kokeellisen ryhmän merisiileihin ruiskutettiin elävän Vibrio diazotrophicus -bakteerin suspensiota 200 µl:ssa steriiliä keinotekoista merivettä siten, että bakteerien määrä säädettiin kullekin merisiilille siten, että se vastasi 106 solua/ml kelanesteen kokonaistilavuudesta. Kontrolliryhmälle annettiin 200 µl steriiliä merivettä. Kunkin ryhmän jokaisesta eläimestä otettiin t = 6, 24 ja 48 tunnin kohdalla 200 µl kelanestettä. Jokaisena ajankohtana saaduista kelomosyyteistä uutettiin RNA, ja t = 0 -näytteistä valmistettiin myös genomista DNA:ta. Geeniekspressioanalyysissä käytettävät alukeparit (lisätaulukko 3) testattiin ensin genomisilla DNA-näytteillä sen varmistamiseksi, että ne pystyvät monistamaan vastaavan geenin jokaisesta yksilöstä huolimatta niiden sekvenssin huomattavasta polymorfiatasosta S. purpuratus -populaatiossa (ks. kuva 1b). Kvantitatiivista RT-PCR:ää (kuten edellä on kuvattu) käytettiin geenien ilmentymistasojen mittaamiseen vähintään kahdella teknisellä toistolla näytettä kohti. Ekspressioarvot normalisoitiin ensin kunkin näytteen 18S-tasoihin ja sitten kunkin eläimen t = 0 -arvoihin. Kokeellisessa ja kontrolliryhmässä käytettiin kolmea biologista toistoa, ja kaikki datapisteet on esitetty.
CDA-määritykset kanamysiiniresistenssireportterilla
Käytettiin optimoitua protokollaa laajalti käytetystä määrityksestä, jolla mitataan polynukleotidien CDA-aktiivisuutta26. KanR-geenin L94P-pistemutaation sisältävä pTAC-Kan-deaminaasireportteriplasmidi ja yksittäiset pASK-SpAIDLX/LaAIDLX-ekspressiovektorit transformoitiin peräkkäin UNG-puutteelliseen BH156 E. coli -kantaan. Ihmisen AID-ekspressiovektori pASK-HsAID ja tyhjä pASK-vektori toimivat positiivisena ja negatiivisena kontrollina. Deaminaasimääritystä varten kunkin oletetun deaminaasin vähintään kahdeksan yksittäistä pesäkettä kasvatettiin LB-liemessä (joka sisälsi 50 μg/ml ampisilliiniä (Amp), 50 μg/ml spektinomysiiniä (Spc) ja 17 μg/ml kloramfenikolia (Cam)), kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä saavutti 0,3:n arvon. Kukin viljelmä jaettiin sitten kahtia. IPTG:tä (1 mM) lisättiin molempiin, mutta anhydrotetrasykliiniä (AHT) (0,2 μg/ml) lisättiin vain toiseen niistä SpAIDLX/LaAIDLX:n ilmentymisen indusoimiseksi. Kun viljelmiä oli inkuboitu 3 tuntia 37 °C:ssa ja 200 rpm:ssä, ne lingottiin, pestiin PBS:llä ja levitettiin LB-levyille, jotka sisälsivät joko 50 μg/ml Ampia, 50 μg/ml Spc:tä ja 17 μg/ml Camia tai 50 μg/ml Ampia, 50 μg/ml Spc:tä, 17 μg/ml Camia ja 30 μg/ml kanamysiiniä (Kan). Palautumisfrekvenssit laskettiin KanR-pesäkkeiden lukumäärän ja Amp+Spc+Cam-levyn pesäkkeiden kokonaismäärän suhteena. Suhteellinen palautumisfrekvenssi määritettiin sitten yhden parin identtisten bakteeriviljelmien palautumisfrekvenssien suhteena, joissa KanR-transkriptio indusoitiin IPTG:llä joko deaminaasi-ekspression läsnä ollessa tai ilman sitä. Sen varmistamiseksi, että KanR-pesäkkeet todella olivat DNA:n deaminoinnin tulosta, useista pesäkkeistä saadut pTAC-Kan-plasmidit puhdistettiin ja stop-kodonin reversio varmistettiin DNA:n sekvensoinnilla.
CDA-määritykset, joissa käytetään rpoB:tä reportterina
Käytettiin optimoitua protokollaa laajalti käytetylle määritykselle, jolla mitattiin polynukleotidien CDA:n aktiviteetteja35. Selkärangattomien deaminaasien yksittäiset pASK-ekspressiovektorit transformoitiin erikseen UDG-puutteelliseen BH156 E. coliin. Neljä millilitraa LB-väliaineen viljelmiä, jotka sisälsivät 100 µg/ml Amp, 17 µg/ml Cam ja 0,3 µg/ml AHT, inokuloitiin yksittäisillä bakteeripesäkkeillä. Viljelmiä kasvatettiin 24 tuntia 37 °C:ssa 230 rpm, aliquotteja viljeltiin LB-agarilevyille, jotka sisälsivät 100 µg/ml Ampia tai 100 µg/ml rifampisiinia, ja niitä kasvatettiin 37 °C:ssa yön yli. Pesäkkeet laskettiin ja reversiotaajuudet laskettiin RifR-pesäkkeiden lukumäärän ja samasta viljelystä saatujen AmpR-pesäkkeiden lukumäärän suhteena. HsAID:ia ilmentävät tai tyhjää pASK-ekspressiovektoria sisältävät viljelmät toimivat positiivisena ja negatiivisena kontrollina. Jokaista ekspressiokonstruktiota kohti testattiin vähintään kahdeksan viljelmää. Rifampisiinille resistenttien pesäkkeiden rpoB-geenin mutaatioiden tunnistamiseksi tehtiin pesäkkeiden PCR 24 yksittäisestä pesäkkeestä käyttäen Phusion-polymeraasia ja rpoBF/rpoBR-aloitinparia. PCR-tuotteet puhdistettiin geelillä ja sekvensoitiin rpoBF-alukkeella. Mutaatiot tunnistettiin vertaamalla WT-sekvenssiin (Genbank acc. CP024859.1, nt 2321219-2321797).
Proteiiniekspressio selkärangattomien deaminaasien E. coli -bakteerissa
SpAIDLX:n/LaAIDLX:n ekspressiotason seuraamiseksi deaminaasimäärityksissä pASK_V5-SpAIDLX/LaAIDLX:ää transformoitiin UNG-puutteelliseen BH156:een. Yksittäisiä pesäkkeitä kasvatettiin LB-liemessä (joka sisälsi 50 μg/ml Ampia, 50 μg/ml Spc:tä ja 17 μg/ml Camia), kunnes optinen tiheys 600 nm:ssä oli 0,3. Viljelmään lisättiin IPTG:tä (1 mM) ja AHT 0,2 (μg/ml) proteiiniekspression indusoimiseksi. 3 tunnin inkuboinnin jälkeen (37 °C, 200 rpm) viljelmät pelletoitiin ja pestiin PBS:llä. Pelletit lysoitiin 2x SDS-näytepuskurissa, laimennettiin kymmenkertaisesti ja erotettiin 10 % SDS-PAGE-geeleillä. Toinen geeli värjättiin Coomassie-sinisellä sen arvioimiseksi, oliko proteiineja latautunut yhtä paljon, toinen geeli siirrettiin PVDF-kalvoille puolikuivalla siirrolla, ja V5-merkityt deaminaasit havaittiin käyttämällä hiiren anti-V5- primaarista vasta-ainetta (Abcam, ab27671) ja piparjuuriperoksidaasiin sidottua kanin ja hiiren välistä sekundaarista vasta-ainetta (Jackson ImmunoReasearch). Kemiluminesenssisignaalit visualisoitiin käyttämällä Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substratea (Millipore) ja röntgenfilmiä tai ChemiDoc Touch -kuvausjärjestelmää (BioRad). Leikkaamattomat kuvat kaikista värjätyistä proteiinigeeleistä ja western bloteista on esitetty täydentävässä kuvassa 5. Kaikki bakteerien ilmentymiskokeet tehtiin kahtena kappaleena.
Bioinformatiikka
Sekvenssivertailut merisiilin genomiin tehtiin käyttämällä BLAST-, BLASTP- tai BLASTN-ohjelmia osoitteessa https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi tai www.echinobase.org käyttäen joko vakioparametreja tai matalan monimutkaisuuden suodatin pois päältä. Moninkertaiset sekvenssikohdistukset tehtiin CLUSTALW-ohjelmalla ja optimoitiin manuaalisesti ennustettujen sekundääristen rakennepiirteiden perusteella. Fylogeneettiset ja molekyylievoluutioanalyysit tehtiin MEGA:lla (versio 7)36.
Tietojen saatavuus
Tämän tutkimuksen tuloksia tukevat sekvenssitiedot on talletettu Genbankiin seuraavilla liittymiskoodeilla: SpAIDL1 (MH106904, MH106887, MH106888, MH106889, MH106890, MH106891), SpAIDL2 (MH048921, MH048922, MH048923, MH048924, MH048925), SpAIDL3 (MH106892, MH106893, MH106894, MH106895, MH106896, MH106897), SpAIDL4a (MH106905, MH080287, MH080288, MH080289, MH080290), SpAIDL9 (KY241384, KY241385, MH106898, MH106899, MH106900, MH106901, MH106901, MH106902, MH106902, MH106903), LaAIDL1 (MH106906), LaAIDL2 (MH106907).