Aktivoituneeseen stimuloivaan G-proteiiniin sitoutuneen kalvon adenyylisyklaasin rakenne

Membraani-integraaliset adenylyylisyklaasit (AC:t) ovat nisäkkäiden signaalinsiirrossa keskeisiä proteiineja, jotka reagoivat suureen joukkoon solunulkoisia ja solunsisäisiä vihjeitä ja tuottavat syklistä adenosiinimonofosfaattia (cAMP:aa) monenlaisten jatkoketjussa tapahtuvien signaalitapahtumien aikaansaamiseksi (1, 2). Kalvon AC:t integroivat useita signaalikaskadeja – esimerkiksi yhdistämällä G-proteiinikytkentäisten reseptorien (GPCR) syötteet, solunsisäisten Ca2+-pitoisuuksien muutokset (3) ja lipidien signaalikaskadit (4). Nisäkkäillä on yhdeksän AC-alatyyppiä, jotka luokitellaan AC1-AC9 (5). Aminohapposekvenssin perusteella kaikilla AC-alatyypeillä on sama ennustettu kokonaisarkkitehtuuri. Ne ovat polytooppisia kalvoproteiineja, jotka koostuvat 12 transmembraanisesta (TM) heliksistä ja joilla on sytosoliset N- ja C-terminaalit. AC-polypeptidin kuutta ensimmäistä TM-domeenia (TM1-TM6) seuraa sytosolinen alue, joka sisältää katalyyttisen domeenin (C1a), jota seuraa C1b-domeeni, toinen TM-alue, TM7-TM12-kimppu, ja sitten toinen katalyyttinen domeeni (C2a) ja C-terminaalinen C2b-domeeni. Proteiinien N- ja C-terminaaliset osat ovat hyvin vaihtelevia, kun taas konservoituneimmat osat ovat C1a- ja C2a-domeenit, jotka kuuluvat luokan III nukleotidyylisyklaaseihin (5, 6). Kimeerisen AC5C1/AC2C2:n röntgenkristallografia kompleksissa stimuloivan G-proteiinin alayksikön Gαs:n kanssa (7, 8) paljasti AC:n katalyyttisen koneiston keskeiset piirteet ja auttoi G-proteiiniriippuvaisten AC:iden cAMP-tuotannon yksityiskohtaisen mekanismin muotoilussa (7, 8). Jokaisessa nisäkkäiden kalvo-AC:ssä on kuitenkin ylimääräisiä rakenneosia, kuten kalvoa läpäisevä domeeni ja helikaalinen domeeni (HD), jotka ovat kriittisiä näiden proteiinien oikealle kokoonpanolle ja niiden entsymaattiselle toiminnalle.

Nisäkkäiden ensimmäisen AC:n kloonauksen myötä tuli ehdotus, että AC:t saattaisivat muistuttaa transportereita (9). Varhaiset tutkimukset Parameciumissa esiintyvistä AC:ista viittasivat siihen, että proteiinin TM-osa saattaa toimia ionikanavana (10). Yhteensopivasti niiden kanavatoiminnon kanssa Paramecium AC:n TM-osan sekvenssi on homologinen jänniteohjattujen kaliumkanavien sekvenssin kanssa (11). Polytooppisen TM-kierteiden nipun ja sytosolista adenosiini-5′-trifosfaattia (ATP) sitovan domeenin läsnäolo viittaavat pinnalliseen rakenteelliseen ja toiminnalliseen samankaltaisuuteen ATP:tä sitovien kasettien (ABC) kuljettajien kanssa. AC:n ja minkään tunnetun transporterin kaltaisen tai ionikanavan kaltaisen proteiinin välillä ei kuitenkaan ole merkittävää sekvenssiyhdenmukaisuutta. Mykobakteerien ja nisäkkäiden AC:n tutkimukset osoittivat TM-domeenien mahdollisen roolin entsyymin oikeassa kokoonpanossa (7, 12, 13). TM-alueen rakenteellinen ja toiminnallinen rooli on kuitenkin edelleen epäselvä.

AC9 on syklaasin alatyyppi, joka ilmentyy monissa kudoksissa, kuten keuhkoissa, aivoissa ja sydämessä (14, 15). Sitä on tutkittu laajasti yhdessä A-kinaasia ankkuroivan proteiinikompleksin (AKAP) kanssa (16). On ehdotettu, että AC9 liittyy AKAP Yotiaon kautta IKs-kaliumkanaviin, proteiinikinaasi A:han, fosfodiesteraasi PDE4D3:een ja proteiinifosfataasi PP1:een (17). AC9 on tunnistettu mahdolliseksi lääkekohteeksi astmassa (5). rs2230739, AC9:n polymorfismi, joka johtaa Ile772→Met-mutaatioon, liittyy muutoksiin vasteessa inhaloitavalle kortikosteroidille budesonidille (18). AC:n aktivaation kanonisessa mallissa forskoliini sitoutuu katalyyttisen paikan vieressä olevaan allosteriseen kohtaan, mikä johtaa entsyymin aktivoitumiseen. AC:n ja Gαs-alayksikön vuorovaikutus guanosiini-5′-trifosfaattiin (GTP) sitoutuneessa tilassa johtaa myös AC:n aktivoitumiseen, ja AC:n maksimaalinen aktivoituminen saavutetaan sekä forskoliinin että Gαs-proteiinin läsnä ollessa. Vaikka sekvenssivertailut muiden AC:iden kanssa osoittavat, että AC9:ssä on allosteerinen kohta, ja eräässä aiemmassa raportissa ehdotettiin, että forskoliini voi aktivoida AC9:n (14), useissa tutkimuksissa päädyttiin kuitenkin siihen, että AC9 on forskoliinille epäherkkä, ja alan yksimielisyys on ollut se, että AC9 kuuluu omaan luokkaansa forskoliinille epäherkkänä valkuaisaineena (19, 20).

Ac:t ovat pitkään pysyneet puuttuvana palasena signaalinsiirron ymmärtämisessä, mahdollisesti siksi, että näiden proteiinien ilmentäminen ja puhdistaminen biokemiallisia ja rakenteellisia tutkimuksia varten on tunnustetusti ollut vaikeaa (21). Täyttääksemme tämän aukon määritimme naudan AC9:n rakenteen kompleksissa Gαs:n kanssa (AC9-Gαs) käyttäen kryoelektronimikroskopiaa (cryo-EM) ja yhden hiukkasen analyysiä.

Ekspressoimme ja puhdistimme naudan AC9:n (kuva S1A) ja vahvistimme sen toiminnallisen eheyden cAMP-akkumulaatiomäärityksillä (kuva 1, A-C). Puhdistettu proteiini katalysoi ATP:n muuntamista cAMP:ksi ja sitä voitiin inhiboida MANT-GTP:llä (2ʹ-/3ʹ-O-(Nʹ-metyyliantraniiloyyli)guanosiini-5ʹ-O-trifosfaatti), joka on inhiboiva AC:n substraattianalogi (Kuva 1B). Proteiinin rekonstituutio GTPγS-aktivoidulla Gα:lla (kuva S1, B ja C) johti syklaasin voimakkaaseen aktivoitumiseen (kuva 1A). Testit universaalin AC-aktivaattorin forskoliinin kyvystä aktivoida AC9:ää in vitro paljastivat AC9:n hyvin heikon aktivoitumisen submillimolaarisissa pitoisuuksissa (kuva 1A). Sitä vastoin forskoliini pystyi aktivoimaan AC9-Gαs-kompleksin tehollisen pitoisuuden (EC50) mediaanilla, joka oli 111 μM (kuva 1A ja taulukko S2). Näin ollen, vaikka sekä forskoliini että Gαs-alayksikkö kykenivät osittain aktivoimaan proteiinin, täysi aktivaatio saavutettiin vain yhdistämällä nämä kaksi ainetta. Lisäksi, kuten AC:n allosteriselta modulaattorilta odotettiin, forskoliini siirsi AC9-substraattianalogin MANT-GTP:n keskimääräistä inhiboivaa pitoisuutta (IC50) kohti pienempää pitoisuutta (Kuva 1, B ja C). Näin ollen in vitro -kokeemme, joissa käytimme puhdistettua täyspitkää AC9:ää ja Gαs-proteiinia, osoittavat selvästi, että forskoliini vaikuttaa AC9-Gαs-proteiinikompleksiin klassisena allosteerisena aktivaattorina.

Valmistimme jäädytettyjä, hydratoituja kryo-EM-ritilöitä, jotka sisälsivät AC9-Gαs-kompleksin MANT-GTP:n ja forskoliinin läsnäollessa pitoisuuksina (0,5 mM kummallekin ligandille), jotka ylittävät näiden kahden yhdisteen IC50- ja EC50-arvot, ja teimme niille yhden hiukkasen kryo-EM-analyysin (kuva S2). Partikkelien parhaasta osajoukosta saatiin tiheyskartta, joka vastaa syklaasin ja G-proteiinin alayksikön täydellistä kompleksia, joka on tarkennettu 3,4 Å:n resoluutioon (kuva 1D). Täydellinen tiheyskartta yhdessä karttojen kanssa, jotka saatiin kompleksin kalvoon upotettujen (kuva S3) ja sytosolisten (kuva S3) osien kohdennetun tarkennuksen jälkeen, mahdollisti täydellisen kolmiulotteisen (3D) mallin rakentamisen AC9-Gαs-kompleksista (kuva 1E). Kartta ja malli paljastivat useita AC9-Gαs-kompleksin keskeisiä elementtejä: (i) AC9:n 12-TM-domeenin nipun, (ii) TM-nipun ja AC9:n katalyyttisen domeenin yhdistävän HD:n ja (iii) AC9:n katalyyttisen domeenin, joka on sidottu GTPγS:llä aktivoituun Gαs-alayksikköön (Kuva. 1, D ja E sekä kuva S6).

Proteiinin TM-domeenilla on pseudokaksinkertainen symmetria, joka on ominaisuus, joka esiintyy usein resistenssin nodulaatiojaon, ABC- tai major facilitator -perheen liuotinsiirtimissä (kuva 2, A-C). Transmembraanihelikit TM1-TM6 ja TM7-TM12 voidaan asettaa päällekkäin 3,4 Å:n keskimääräisellä neliöpoikkeamalla (RMSD) 176 jäännöksellä (kuva 2D). Sisäinen pseudosymmetria tukee hypoteesia, jonka mukaan nisäkkäiden kalvo-AC:t ovat syntyneet geeniduplikaatiotapahtumalla yksinkertaisesta systeemistä, joka on mahdollisesti samanlainen kuin Mycobacterium tuberculosis -bakteerin ”puolisyklaasi” Cya/Rv1625c (12). AC9:n kahden TM-puoliskon välisen rajapinnan muodostavat kierteet TM1, TM4 ja TM6 TM-domeeninipun N-terminaalisessa ”puoliskossa” ja TM7, TM10 ja TM12 proteiinin C-terminaalisessa osassa (kuva 2, B ja C). Ensimmäisen nisäkkään AC-geenin kloonaukseen liittyi niiden primaarisen sekvenssin perusteella ehdotus siitä, että AC:t saattavat toimia kuljettajina (9). Rakenteemme ei paljasta mitään ilmeistä oletettua liuenneen aineen translokaatioreittiä TM-domeenin nipussa, ja AC9:n TM-helikit ovat tiiviisti pakkautuneet toisiinsa. Vaikka digitoniinimikkeli tarjoaa todennäköisesti samanlaisen ympäristön kuin lipidikaksoiskerros, on mahdollista, että TM-heliksien konformaatio kalvon fysiologisessa ympäristössä on erilainen.

Ac9:n TM6- ja TM12-heliksit ulottuvat sytosoliin muodostaen 40-residyylin pituisia HD:itä, joita kutsutaan tässä HD1:ksi (mukaan lukien heliksit h1.1 ja h2.1) ja HD2:ksi (heliksit h2.1 ja h2.2; kuva 2, E ja F). Tämä alue on tärkeä AC:iden ja guanylyylisyklaasien toiminnalle prokaryooteissa ja eukaryooteissa (12). Kierteen h1.1 Leu323-Met333 jäännökset ja kierteen h2.1 Ile1022-Leu1032 jäännökset muodostavat klassisen kierteen (kuva 2F). Kuvasimme aiemmin M. tuberculosis Rv1625c:n kanssa homologisen Mycobacterium intracellulare -bakteerin kalvo-AC:n Cya:n HD:n (12). AC9:n HD:ssä on joitakin eroja Cyaan verrattuna ydinalueen suhteellisessa sijoittelussa katalyyttisen domeenin rajalla (kuva 2, E ja F, ja kuva S7, A ja B). M. intracellulare Cya:ssa lyhyet heliksit ovat tiukasti sidottuina kelan C-päätteeseen (kuva S7B). Sitä vastoin AC9:n kierukka purkautuu h1.1:n ja h2.1:n C-terminaalisissa päissä (kuva 2F, kuva S7B ja kuva S8A). Tämä entsyymin alue on kriittinen AC:iden ja guanyylysyklaasien toiminnalle. Geneettiset tautiin liittyvät mutaatiot kartoittavat AC5:n HD-mutaatioita familiaalisessa dyskinesiassa ja kasvojen myokymiassa (22, 23) ja retinaalin guanyylylisyklaasin (retGC1) HD-mutaatioita Leberin synnynnäisessä amauroosissa-1 (24) ja kartiopuolidystrofiassa-6 (CORD6) (25). Voimme nyt tarkentaa tautiin liittyvien mutaatioiden sijainteja käyttämällä naudan AC9:n rakennetta, joka on paljon lähempänä ihmisen patologiaan liittyviä nukleotidyylisyklaaseja kuin M. intracellulare Cya.

Nisäkkäiden AC:n 12-TM-nipun tehtävä on ollut epäselvä. Mykobakteerin Rv1625c:llä hiljattain tehdyt tutkimukset viittasivat mykobakteerin homologin (12) kalvot läpäisevän alueen mahdolliseen reseptoritoimintoon. Emme pystyneet erottamaan AC9:n solunulkoisen pinnan osia (kuva 2, A ja B), eikä ole selvää, onko proteiinin kalvoon sidotussa osassa toiminnallisesti merkityksellisiä sitoutumiskohtia hypoteettisille ligandeille. Samoin C1b-domeenia, joka yhdistää katalyyttisen C1a-domeenin ja TM7:n, ei pystytty erottamaan rekonstruktiossamme (kuva S6, E-G). Rakenteemme antaa kuitenkin viitteitä siitä, miten vuorovaikutukset kalvot ylittävän alueen kanssa voisivat vaikuttaa proteiinin katalyyttiseen toimintaan. Heliksit TM6 ja TM12 ovat jatkuvia HD:n h1.1:n ja h2.1:n kanssa. TM6 ja TM12 sijaitsevat TM1-TM6- ja TM7-TM12-helikaalikimppujen rajapinnassa ja ovat sivusuunnassa alttiina lipidikaksoiskerrokselle (kuva 2E ja kuva S8B). On ajateltavissa, että TM6:n tai TM12:n suorat vuorovaikutukset lipidien, pienten molekyylien tai muiden proteiinien kanssa voisivat suoraan vaikuttaa katalyyttiseen domeeniin muuttamalla heliksen h1.1 ja h2.1 orientaatiota (kuva S8B).

Kokonaan AC9:n katalyyttinen domeeni koostuu kahdesta puolikkaasta, C1a:sta ja C2a:sta (kuvat 1E ja 3A), jotka ovat samankaltaisia kuin kalvo-AC:iden liukoisten domeenien aiemmin ratkaistut röntgenrungon rakenteet (kuva S7, A ja C). HD-alue h1.2 (jäännökset 340-360) on lähellä Gαs-interaktiopintaa (kuva S7E). Tämä proteiinin alue näyttää olevan erittäin dynaaminen, emmekä pystyneet ratkaisemaan AC9:n His361:n ja Pro384:n yhdistäviä jäämiä (kuva S7E). Tämän alueen läheisyys G-proteiinin ja AC:n rajapintaan viittaa kuitenkin siihen, että tämä AC9:n rakenteen elementti osallistuu todennäköisesti AC9:n ja Gα:n väliseen vuorovaikutukseen.

Havaittiin ATP:n sitoutumiskohdan ja forskoliinikohdan sisällä sijaitseva vahvan tiheyden elementti (kuva 3, A ja B, ja kuva S9, A-C). Tämä tiheys osoitti pinnallista samankaltaisuutta MANT-GTP-tiheyden kanssa, mutta ei vastannut sen odotettua sijaintia (kuva 3A). Forskoliinipaikan tiheys näytti olevan päällekkäinen forskoliinin odotetun sijainnin kanssa (kuva 3A). Samanlainen tiheyspiirre esiintyi kartassa, joka rekonstruoitiin kuvista, jotka otettiin näytteestä, jossa ei ollut forskoliinia (kuva 3B ja kuva S9B). Näin ollen MANT-GTP:n ja/tai forskoliinin läsnäolosta riippumatta aktiiviset ja allosteeriset paikat näyttävät olevan peptidin kanssa yhdenmukaisen tiheyden vallassa (kuva 3, A ja B, ja kuva S9, A ja B). Tarkennettu 3D-luokittelu ja tarkennus paljastivat yhteyden tämän tiheyden ja AC9:n C2a-domeenin C-terminaalisen alueen välillä (kuva 3C ja kuvat S3 ja S9C). Vaikka tiheyspiirteet tässä vähemmän asutetussa 3D-luokassa (SOL-C-kartta, laskettu vain 16 343 hiukkasella) eivät ole riittävän vahvoja atomiproteiinimallin luomiseksi luotettavasti, käyttämällä käytettävissä olevaa tiheyttä rajoitteena pystyimme osoittamaan sen AC9:n C-terminaalin eli C2b-domeenin jäännöksille Cys1246-Pro1275 (kuva 3C ja kuva S9C). Allosterisen ja aktiivisen alueen sisällä olevan tiheyden korkea laatu (kuva 3A ja kuva S9, A ja D) mahdollisti sen, että pystyimme rakentamaan sulkupeptidin mallin, joka vastaa AC9:n C2b-domeenin jäännöksiä Ile1263-Pro1275 (kuva S9D). Tämä alue on erittäin konservoitunut selkärankaisten AC9-homologeissa (kuva S9E), mutta ei muissa AC:n isomuodoissa (AC1-AC8) (kuva S10).

Tarkistaaksemme C2b-domeenin funktionaalisen roolin AC9:ssä vertasimme villityypin ja C2b-domeenia vailla olevan typistetyn proteiinin AC91250 entsymaattisia ominaisuuksia (kuva 3D ja kuva S11A). Nämä kaksi konstruktiota osoittivat vertailukelpoista kykyä muuntaa ATP:tä cAMP:ksi, ja niiden Michaelis-vakio (Km) ja Vmax-arvot olivat samankaltaiset (kuva 3E ja taulukko S2). AC91250 aktivoitui forskoliinilla ja inhiboitui MANT-GTP:llä samalla tavalla kuin AC9 (kuva S11, B-D). Gαs:n lisääminen stimuloi voimakkaasti AC9:n cAMP-tuotantoa (kuva 3F), ja samanaikaisesti sen Km ATP:lle kasvoi. Yhdenmukaisesti ATP:n sitoutumista estävän hännän kanssa AC91250:llä oli korkea Vmax-arvo, mutta paljon alhaisemmalla Km-arvolla (kuva 3F). Tämä on vahva osoitus siitä, että C2b-alueella on toiminnallinen rooli AC9:n G-proteiiniin sitoutuneessa tilassa. C2b-alueen poistaminen lisää AC9:n affiniteettia ATP:hen Gα:n läsnä ollessa, jolloin proteiini saavuttaa maksimaalisen katalyysinopeuden paljon pienemmillä ATP-pitoisuuksilla. Substraatin (ATP) affiniteetin pienentäminen C2b-domeenilla, joka sulkee C2b-domeenin aktiivisen alueen, voi olla säätelymekanismi, jolla G-proteiiniin sidotun AC9:n cAMP-tuotantoa ohjataan.

Arvioidaksemme konformaatiomuutoksia AC9:n okkludoituneessa tilassa määritimme AC91250-Gαs-kompleksin kryo-EM-rakenteen MANT-GTP:n ja forskoliinin läsnäollessa (AC91250-Gαs-MF; Kuva 3, G ja H, ja kuvat S12 ja S13). Rekonstruktio 4,2 Å:n resoluutiolla mahdollisti sen, että pystyimme selvästi erottamaan tiheyden MANT-GTP:lle ja forskoliinille, jotka ovat sitoutuneet niiden kanonisiin sitoutumiskohtiin (kuvat 3, G ja H, ja 4; kuva S13, E-G). AC91250-Gαs-MF- ja AC9-Gas-kompleksien katalyyttisen domeenin järjestelyn vertailu paljasti C1a:n pienen suhteellisen uudelleenjärjestäytymisen, joka on riippuvainen sulkeutuvan peptidin läsnäolosta aktiivisessa ja allosteerisessa paikassa (Kuva. 4, A ja B; kahden vertaillun rakenteen liikkuvien C1a-domeenien (Ile1380-Gln574) atomien välinen RMSD niiden C2a-domeenien (Gln1049-Lys1245) avulla kohdistettujen rakenteiden välillä on 1,9 Å. AC9:n okkludoituneessa tilassa havaittu hienovarainen koko domeenin liike siirtää C1a:n aminohappojäännöksiä, jotka ovat osallisina nukleotidisidonnaisuudessa, ~3 Å:lla (kuva S13H). Näin ollen AC9:n katalyyttinen ydindomeeni omaksuu okkludoidun konformaation, jolloin C2b:stä peräisin oleva peptidi miehittää proteiinin aktiivisen ja allosteerisen alueen (kuva S9, D ja E) ja samalla aktiivinen alue vääristyy verrattuna MANT-GTP:hen ja forskoliiniin sitoutuneessa tilassa havaittuun.

AC9-Gαs-kompleksin rakenne okkludoituneessa konformaatiossa mahdollisti sen, että voitiin tarkastella uudelleen vakiintunutta mallia cAMP:iin perustuvasta signaalinsiirrosta (7, 26) (kuva S14). GPCR-kaskadin aktivoitumisen on johdettava AC:n Gαs-alayksikköön sitoutuneen muodon muodostumiseen cAMP:n tuottamiseksi. Tässä kuvattu suljettu tila lisää kuitenkin välivaiheen, jota ei ole aiemmin arvostettu. AC9:n suljettu tila ja aktiivinen tila ovat todennäköisesti tasapainossa; näyte, joka tuotti suljetun tilan rekonstruktion, voidaan aktivoida G-proteiinilla ja se voi tuottaa cAMPia. Proteiinin huomattavasti alentunut Km ATP:lle (kuva 3F) viittaa lisäksi siihen, että ATP-kohdan sulkeutumista voidaan suosia G-proteiinin läsnä ollessa. Tulevat kokeet auttavat määrittelemään tämän proteiinikonformaation toiminnallisen roolin AC9:n katalyyttisessä syklissä.

Tässä tutkimuksessa paljastunut AC9:n arkkitehtuuri antaa viitteitä kalvoon kiinnittyneiden osien mahdollisesta roolista nisäkkäiden AC:ssä. Yksi kalvodomeenin ilmeinen tehtävä on mahdollistaa aktiivisen syklaasin oikea kokoaminen. Tämä tapahtuu siten, että TM6 ja TM12 muodostavat kehyksen HD:lle. On todennäköistä, että proteiinin osat, joita ei tällä hetkellä voida erottaa, eli N-pääte ja C1b-domeeni, osallistuvat AC9:n syklaasitoiminnan kokoamiseen ja säätelyyn (kuva S6, E-G). Näin ollen huolimatta siitä, että katalyyttinen domeeni on erotettu ~40 Å:lla lipidikaksoiskerroksesta, on ajateltavissa, että proteiinin kalvo-osuus voi vaikuttaa katalyyttiseen domeeniin HD:n ja sen viereisten silmukka-alueiden kautta.

Kompleksin okkludoitunut tila, jossa C-terminaalinen peptidi sitoo sekä AC9:n aktiivisen että allosteerisen paikan, voi edustaa tärkeää autoregulaatiomekanismia, joka on sisäänrakennettu AC:hen perustuvaan signaalinsiirtokoneistoon. Peptidin läsnäolo voi auttaa selittämään epäjohdonmukaiset havainnot AC9:n forskoliini-epäsensitiivisyydestä (14, 19, 20), mikä tukee AC9:n kontekstiriippuvaista autoregulaatiota. Forskoliini-iini on kasviperäinen pienimolekyylinen AC:n aktivaattori; AC:n tämän kohdan luonnollisen aktivaattorin tai inhibiittorin on oletettu olevan olemassa (20), mutta sitä ei ole toistaiseksi tunnistettu. AC9:n tapauksessa voimme nyt osoittaa, että i) forskoliini kykenee aktivoimaan entsyymin ja ii) allosterikohdan todennäköinen luonnollinen säätelijä on C2b-domeenin osa, joka sitoutuu proteiinin aktiiviseen alueeseen. Ehdotamme, että G-proteiinin suorittaman aktivoinnin jälkeen (kuva S14, A-D) C2b sulkee AC9-reaktiokeskuksen ja estää entsymaattisen aktiivisuuden, mikä estää cAMP:n liiallisen tuotannon solussa (kuva S14E). Tämä on sopusoinnussa tuoreen raportin kanssa AC9:n C2b-domeenin autoinhiboivasta toiminnasta solukontekstissa (27). Löydöksemme voivat auttaa tasoittamaan tietä kohti uusien lähestymistapojen luomista lääkekeksintöihin, joissa hyödynnetään AC9-Gα:n rakenteen paljastamaa autoregulatorista molekyylimekanismia.